果膠酶高產菌微紫青霉SW09的鑒定及發酵特征

摘要：從云南煙田采取土樣多份，以果膠為惟一碳源，通過初篩和搖瓶復篩，篩選到l株果膠酶高產真菌SW09。通過菌落形態觀察、生理生化指標試驗和l8S rDNA保守序列分析，經初步鑒定為微紫青霉，將其命名為Penicillium janthinellum SW09，并以發酵罐深層液體培養確定其發酵生長周期為72 h，產聚半乳糖醛酸酶活力最大達到3 071.99 U/mL，為煙梗果膠質的生物降解奠定基礎。

關鍵詞：聚半乳糖醛酸酶；微紫青霉；生長周期

中圖分類號：Q946.5；Q93-331 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0337-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.017

果膠酶是由多種組分組成的復合酶，多種組分協同完成果膠的降解[1]。天然來源的果膠酶廣泛存在于動植物和微生物中，但動植物來源的果膠酶產量低，難于大規模提取制備，微生物因具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊和分布廣泛等特點而成為果膠酶的重要來源，因此微生物是生產果膠酶的優良生物資源[2-5]。果膠酶廣泛應用于食品工業、飼料工業、造紙工業和紡織工業中，由于一般果汁的自然pH為3.0～4.0，所以食品工業的果膠酶多為酸性果膠酶。

聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的最重要組分，專一性地分解果膠質中2個非酯化半乳糖醛酸間的糖苷鍵，使果膠很快從大分子降解為分子量較小的低聚糖類，因此，聚半乳糖醛酸酶的活力在很大程度上代表了果膠酶的活力[6]。果膠酶制劑的工業化生產始于20世紀50年代，主要生產國有德國、法國、意大利、丹麥、荷蘭、日本等。這些國家在陸續解決了菌種、發酵方法、制劑方法等問題后，果膠酶制劑得到了規模化生產。目前中國已能生產果膠酶，但是純度和活性都不高。因此，選育高產菌株來提高聚半乳糖醛酸酶的產率和降低產酶成本，對研究開發和應用聚半乳糖醛酸酶具有重要的意義。本研究以果膠為惟一碳源，通過初篩和搖瓶復篩，篩選果膠酶高產菌株并對其液體發酵進行研究，為大規模發酵產果膠酶提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣 土樣由鄭州輕工業學院食品與生物工程學院重點實驗室從云南省煙田采集的土壤中分離得到。

1.1.2 培養基 分離培養基：果膠5.0 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，瓊脂25.0 g/L，pH 5.8。

定性驗證培養基：2%果膠瓊脂培養基。

液體種子培養基：果膠5.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，FeSO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，pH 6.0，裝液量100 mL于250 mL錐形瓶。

基礎液體培養基：葡萄糖30.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，果膠0.5 g/L，pH 6.0。

1.1.3 主要試劑和儀器 3，5-二硝基水楊酸（DNS，天津市華東試劑有限公司）；果膠粉（天津市風船化學試劑有限公司）；D-半乳糖醛酸標準品（97%，Sigma-Aldrich公司）；PCR系列試劑2×Taq MasterMix（含染料，北京康為世紀生物科技有限公司）；UNlQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司）。

BS200S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SN-CJ IFD型雙人雙面超凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；UV-17001C型紫外分光光度計（上海鳳凰光學科儀有限公司）；HH-4型電熱數字恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；CF-16RXⅡ型冷凍離心機（Hitachi）；SFLY-100B型臺式小容量恒溫培養搖床（上海申賢恒溫設備廠）；SPX-160B-2型恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 果膠酶生產菌的分離及菌落形態特征 用稀釋平板法處理土壤樣品，單孢分離法分離純化目的菌株。采集的土樣分別溶解到生理鹽水中，靜置2 h，吸取上清液，分別稀釋到10-3、10-5、10-7并涂布于篩選平板上，28 ℃培養2 d，挑取經剛果紅染色產生較大透明圈單菌落的真菌單個孢子至定性培養基中，于28～30 ℃生化培養箱內培養4～7 d，挑取單菌落，獲得純菌種，無菌操作[7]。對初篩的結果進行搖瓶復篩擴大培養，采用DNS法測定聚半乳糖醛酸酶活力，選取果膠酶活性高的菌株進行菌落、形態觀察和菌株鑒定，培育出高產菌株。

1.2.2 聚半乳糖醛酸酶（PG）活力測定方法 參照Miller（1959）[8]的方法。取0.4 mL 1%果膠溶液于試管中，加入1.0 mL pH 5.0的0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L檸檬酸緩沖液，45 ℃水浴平衡5 min。加入0.1 mL適當稀釋的酶液，45 ℃反應30 min（空白對照組以煮沸失活的酶液代替），加入3.0 mL DNS溶液終止反應，沸水浴5 min，冷卻，定容至15.0 mL，540 nm 波長下用分光光度計測吸光度，得到反應體系中半乳糖醛酸的量。酶活力單位：1 mL酶液在45 ℃、pH 5.0的條件下，每分鐘分解底物產生1 μg半乳糖醛酸的酶量定義為1單位聚半乳糖醛酸酶（PG）酶活，以U/mL表示。

酶活力計算公式：U=（C試驗-C對照）×N×1 000×（V總/V酶）/t。其中，C試驗和C對照分別代表試驗組和對照組的吸光度，N為酶液稀釋倍數，V總為反應總體積，V酶為酶液體積，t為反應時間（min）。

DNS法標準曲線的繪制：配置1.0 mg/mL的半乳糖醛酸標準溶液，取1.0 mg/mL 半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中，補水至1.0 mL，加DNS 試劑3.0 mL，混合后于沸水中煮7 min，冷卻后定容至15.0 mL，于540 nm 波長下用分光光度計測定吸光度。以吸光度為縱坐標，半乳糖醛酸量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 DNA的提取和ITS PCR擴增 將單菌落接種于液體培養基，28 ℃培養2 d，離心取菌絲體冷凍干燥，將干燥的菌絲體經液氮碾磨成細粉，用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA的提取。將得到的DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測：TAE電泳緩沖液，電壓110 V，電泳時間25 min。ULTRA-LUM OMEGA 10凝膠成像系統下觀察照相。以DNA為模板，通過引物ITS1（5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）參照White等[9]的方法進行PCR擴增，PCR反應體系為：2×Taq MasterMix 10.0 μL，DNA模板1.0 μL，ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL，去離子水 8.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性300 s；94 ℃變性45 s；55 ℃退火50 s；72 ℃延伸60 s，33個循環；最終72 ℃充分延伸300 s。取5 μL PCR樣品凝膠電泳20 min，EB染色。在凝膠成像系統中觀察提取DNA的質量并照相記錄[10]。將有條帶的PCR原液送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 ITS序列測定及系統發育分析 將菌株的ITS基因序列提交到NCBI的GenBank核酸序列數據庫并與數據庫中已知的相關序列進行比對，并用MEGA 3.1構建系統發育樹[11]。

1.2.5 最適培養時間的確定及形態學觀察 5 L的發酵罐裝入基礎培養基4 L，離位滅菌后冷卻、接種。設置發酵罐控制參數：溫度28 ℃，攪拌速度150 r/min，進氣量2 m3/（m3·min）。自接種開始，每隔24 h取樣一次。測定其菌絲產量和PG酶活力，確定其最佳培養時間。取平均大小的菌絲球若干，加入等體積固定劑（200 mL 50%乙醇，13 mL 40%甲醛，5 mol/L冰醋酸），用染色劑（0.39%亞甲基藍，30 mL 95%乙醇，100 mL蒸餾水）染色24 h后制片，在40倍下顯微拍照觀察，采用DT2000圖像分析軟件分析不同發酵時間菌絲球的性狀。其中，緊密度=菌核面積/菌絲球面積，粗糙度=（菌絲球的周長）2/（面積×4π）[12]。

2 結果與分析

2.1 產果膠酶菌株的篩選及形態觀察

從所采集的土樣中共分離得到產果膠酶的真菌14株，挑取到定性驗證培養基上純化培養，選取出經過剛果紅染色產生的透明圈直徑較大的菌株6株進行搖瓶復篩，經測定選取出一株產果膠酶活力最高的真菌，命名為SW09。培養4 d即形成較典型的菌落，菌落中間呈黃色，邊緣為白色，直徑約19.0 mm，輪廓規則[13]（圖1A、圖1B）。其菌落呈氈狀，表面絮狀，有放射狀褶裂，產孢面為黃色，后期菌落頂端轉至淡粉色或淡紫色，背面無色至黃色轉橙色，至淡紫色（圖1C）。小梗少而細，長8.0～10.0 μm，寬2.0～2.2 μm，頂端急劇地變細（圖1D）。分生孢子為橢圓形，一端或兩端稍尖，其長徑約3.0～3.5 μm[14]。

2.2 18S rDNA的序列測定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，SW09菌株基因組DNA條帶明亮且清晰（圖2A），可以很好地用于PCR擴增。應用ITS1和ITS4引物對DNA進行PCR擴增，能擴增出比較明亮的條帶且條帶清晰、完整（圖2B），表明擴增的ITS區段大小在560 bp左右。

2.3 系統發育分析

根據基因庫比對結果，在GenBank中下載相近分類元的ITS序列，用Clustal X軟件對這些序列和青霉菌的序列進行初步比對。利用MEGA 3.1軟件進行多重序列比對并繪制系統發育樹（圖3）。進化分析結果表明，SW09菌株與多數青霉屬的真菌具有較近的親緣，其中與微紫青霉（Penicillium janthinellum P49）的親緣關系最近，相似性為99%，因此鑒定此菌株為微紫青霉，命名為Penicillium janthinellum SW09。

2.4 最適培養時間的確定及形態學觀察

2.4.1 半乳糖醛酸標準曲線 根據“1.2.2”的試驗方法，以半乳糖醛酸的濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得到的線性方程為：y=0.772 3x-0.024 5，R2=0.995 1。

2.4.2 最適培養時間的確定 根據發酵罐培養時間內Penicillium janthinellum SW09菌絲干重及產酶量的變化（圖4）。將菌體從種子培養基中接入搖瓶培養基后0～24 h菌絲生長，菌體進入對數期；其后曲線趨于平緩，從24～120 h是菌體的穩定期；120 h后菌體開始自溶，進入衰亡期[13]。確定最佳培養時間為72 h，此時目標產物酶活力達到最大值，為3 071.99 U/mL。基礎培養基的pH在72 h內先略有上升，之后平緩下降（圖4）。殘糖含量一直平穩下降，72 h左右殘糖量下降幅度不明顯，可能是由于微生物代謝糖的產生引起，具體機理有待研究。

2.4.3 形態學觀察 Penicillium janthinellum SW09不同發酵時間菌絲球形態變化和菌絲球平均直徑、緊密度、圓度和粗糙度的變化見圖5。24 h時菌絲球基本為菌絲體纏繞，菌核不明顯；48 h后菌絲體變大，菌絲球緊實，并有菌核產生。菌絲球的外圍菌絲在初期生長十分茂盛，但質地松散，緊密度小。72 h后菌核逐漸增大，菌絲量增大；96 h菌絲球基本呈球狀，外部的菌絲多而緊密，緊密度上升，粗糙度下降。120 h后菌絲體達到穩定成熟。在培養前期菌絲球的圓度和直徑迅速上升（圖6），緊密度與粗糙度也迅速上升，但在培養后期，菌絲球的緊密度降低，同時粗糙度減小，這是由于菌絲球外圍的菌絲生長速度過快，產生分生。

3 結論

利用從煙田土壤中篩選得到一株高產果膠酶的菌株，對其進行了形態學方面的鑒定，并對其進行了 ITS測序，其ITS序列長度為560 bp，根據系統發育樹分析表明該菌株屬于青霉菌屬的微紫青霉，命名為Penicillium janthinellum SW09，系統發育分析表明了該菌在屬內的遺傳地位。通過深層液體發酵培養確定其最佳產果膠酶周期為72 h，產聚半乳糖醛酸酶活力最大，達到了3 071.99 U/mL，菌絲干重隨發酵時間增加逐漸增加，基礎培養基的pH先略有上升之后平緩下降。結果表明，該菌株發酵時間短，產酶活力大，可以作為具有開發潛能的一種資源，而分子生物學的快速發展為真菌的鑒定提供了便捷而又準確的方法。從應用的角度分析，該菌株具有人工馴化的價值，馴化后針對果膠酶活性可以展開發酵工藝的研究，擴大該菌株的應用潛力。

參考文獻：

[1] 張海燕，吳天祥.微生物果膠酶的研究進展[J].釀酒科技，2006（9）：82-85.

[2] 張浩森，繆 靜，余曉斌.幾種因素對黑曲霉產果膠酶不同酶系的影響[J].食品工業科技，2008，29（1）：57-60

[3] 楊欣偉，林偉玲，田寶玉，等.果膠酶高產菌株EIM-6的篩選鑒定及其液體發酵產酶條件優化[J].福建師范大學學報（自然科學版），2009，25（2）：68-74.

[4] 潘仁瑞，吳 克，蔡敬民.微生物酶資源的開發和利用（上）[J].合肥學院學報（自然科學版），2005，15（1）：7-11.

[5] 譚秀華，閆苗苗.環境微生物果膠酶活性研究[J].安徽農業科學， 2009，37（30）：14564-14565.

[6] 李 瑜，樊明濤，袁 暉，等.聚半乳糖醛酸酶高產菌的篩選及產酶條件研究[J].中國釀造，2009（2）：56-59.

[7] 耿月華，張 猛，李 躍，等.河南鄭州玉米田4種暗色絲孢真菌的鑒定[J].安徽農業科學，2014，42（13）：3884-3886.

[8] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959，31（3）：426-428.

[9] WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]. INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press Inc.， 1990.

[10] 趙 爽，許 峰，劉 宇，等.一種珍稀野生真菌鑒定及生理指標測定[J].湖北農業科學，2014，53（4）：826-829.

[11] 應家振，劉明啟，孫淑妮，等.產淀粉酶黑曲霉的分離、鑒定[J].中國科技縱橫，2011（23）：172.

[12] 韓燕峰，梁建東，杜 文，等.蛹蟲草幾個問題的最新研究進展[J].微生物學通報，2009，36（9）：1423-1428.

[13] 藍麗精.高產果膠酶菌株的篩選、發酵條件優化及其應用的研究[D].浙江金華：浙江師范大學，2012.

[14] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.