芽孢桿菌1205和煙草疫霉處理后對(duì)煙苗防御酶的測(cè)定

摘要：分別將煙苗接種芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1205和煙草黑脛病菌病原菌煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）在接種后1、3、5、7、9、11 d測(cè)定煙苗過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種與植物抗病密切相關(guān)的酶活性變化。結(jié)果表明，接種芽孢桿菌1 205后，PAL、PPO活性在5 d時(shí)達(dá)到最高值，明顯高于對(duì)照和接種煙草疫霉，POD活性在接種1 d時(shí)即達(dá)到最高值。而接種煙草疫霉后PAL、PPO活性均在3 d時(shí)達(dá)到最高值，POD活性在接種1 d時(shí)達(dá)到最高值。

關(guān)鍵詞：煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）； 芽孢桿菌（Bacillus subtilis）； 抗性相關(guān)酶

中圖分類號(hào)：S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）02-0362-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.023

煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）是引起煙草黑脛病的惟一病原菌，在自然條件下寄主范圍廣泛[1]，嚴(yán)重為害作物的生長(zhǎng)。在中國云貴川三大煙區(qū)均有不同程度發(fā)生，每年經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)億元，僅次于煙草病毒病[2，3]?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治煙草黑脛病以甲霜靈為主，連年施用甲霜靈使用藥量逐年上升，病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降[4-7]，而且化學(xué)農(nóng)藥容易殘留土壤中污染環(huán)境。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)研究的深入，生物防治煙草黑脛病成為研究重點(diǎn)。植物在受到各種病原生物作用后，植物為維護(hù)其正常生長(zhǎng)發(fā)育而產(chǎn)生一定的防御機(jī)制[8]，其中植物防御酶（如過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL）的誘導(dǎo)產(chǎn)生就是最重要的一種生理生化抗性機(jī)制。

安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從煙草根際土壤中分離得到一株對(duì)煙草黑脛病具有良好抑制作用的芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1205，通過測(cè)定拮抗菌處理對(duì)煙草苗體內(nèi)過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL的變化情況，研究拮抗芽孢桿菌1205對(duì)煙草黑脛病的作用機(jī)理，為生防菌的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草黑脛病病原菌煙草疫霉由貴州大學(xué)生命科學(xué)院真菌資源研究所提供。拮抗細(xì)菌為芽孢桿菌1205。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 接種前準(zhǔn)備 將分離得到的芽孢桿菌1205經(jīng)NA斜面活化后，取兩環(huán)活化的培養(yǎng)物分別接入盛有100 mL NA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min培養(yǎng)3 d，得到拮抗菌株懸浮液。利用已分離出的煙草黑脛病病原菌煙草疫霉Gzufp-9，參照煙草疫霉孢子懸浮液制備方法[9]，制備煙草疫霉懸浮液，游動(dòng)孢子的濃度為104個(gè)孢子/mL。

1.2.2 接種處理 在煙苗長(zhǎng)有4葉1心、苗高3～4 cm時(shí)剪葉，剪去超過盤孔的根系控制大苗生長(zhǎng)，促使小苗生長(zhǎng)。后期剪葉兩次，促進(jìn)莖部的生長(zhǎng)，達(dá)到煉苗的目的[10]。移栽，每盆一株，10 d后進(jìn)行處理。采用王麗珍[11]的方法，將煙草疫霉孢子懸浮液灌根接種于煙株根部土壤中。芽孢桿菌1 205采用灌根接種法，將已經(jīng)制備好的濃度為1×108個(gè)孢子/mL拮抗菌發(fā)酵液灌根接種于煙株根部土壤中。

1.2.3 酶液提取 參照Moerschbacher等的方法[12]。稱取1 g樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入2 mL提取液（0.1 mol/L pH 8.8硼酸鈉緩沖液，內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇，1 mmol/L EDTANa2），0.1 g聚乙烯吡咯烷酮及少許石英砂，冰浴研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2 mL提取液沖洗研缽及研棒，然后一并轉(zhuǎn)入離心管，在4 ℃下振蕩5 min，同樣溫度12 000 r/min離心20 min。上清液即為POD、SOD、PPO和PAL酶粗提液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶活性測(cè)定方法

1）過氧化物酶POD活性測(cè)定。按Cakmak的方法[12]加以改進(jìn)，取50 μL酶粗提液加入5 mL試管中，與4.8 mL含18 mmol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH 5.8）混合。于35 ℃水浴中反應(yīng)1 min后，加入150 μL 2.5%（V/V）H2O2起始酶反應(yīng)，記錄470 nm處的光密度值，每隔1 min記錄一次，連續(xù)記錄5 min（3 min內(nèi)的吸光值變化不超過1個(gè)吸收單位時(shí)，則酶反應(yīng)初始速度與加入的酶量呈線性關(guān)系）。以不加酶液而加相同體積的磷酸緩沖液為空白對(duì)照，以每分鐘OD470變化0.01為一個(gè)酶活單位U，用U/g表示酶活性。

2）多酚氧化酶PPO活性測(cè)定。用比色法測(cè)定[12]：取100 μL酶粗提液加入比色杯中，與4.9 mL含0.02 mol/L鄰苯二酚的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）混合，于35 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，記錄398 nm處的光密度值，以不加酶液而加相同體積磷酸緩沖液為空白對(duì)照。以每分鐘OD398值變化0.01為1個(gè)酶活性單位U，計(jì)算酶比活性U/g。

3）苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶PAL活性測(cè)定。取酶粗提液0.5 mL，去離子水4 mL，與含0.02 mol/L L-苯丙氨酸的硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.8）0.5 mL混勻，以不加酶液而加等體積的磷酸緩沖液為對(duì)照，測(cè)定起始OD290值。將測(cè)定液倒回對(duì)應(yīng)的試管，在38 ℃水浴中反應(yīng)30 min，放入冰浴中終止反應(yīng)，再次測(cè)定OD290值，計(jì)算2次OD290的差值。以每小時(shí)OD290變化0.01為一個(gè)酶活力單位U（相當(dāng)于每mL反應(yīng)混和液中形成1 μg肉桂酸），計(jì)算酶比活性U/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌后煙苗PPO活性的變化

由圖1可知，煙苗經(jīng)芽孢桿菌1205接種1 d后，PPO活性顯著低于接種煙草疫霉病原菌的PPO活性，2 d后迅速上升并與之相接近，而接種煙草疫霉病原菌3 d后，煙苗PPO活性達(dá)到最高峰0.389 U/g，是清水對(duì)照的近兩倍。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，活性逐漸降低。接種芽孢桿菌1205 5 d后，煙苗PPO活性達(dá)到0.509 U/g，高于接種煙草疫霉病原菌，是清水對(duì)照的近三倍，在5～7 d酶活性還保持在一個(gè)較高的水平。表明CK和芽孢桿菌1205在5 d時(shí)達(dá)到最高峰，且芽孢桿菌1205的峰值顯著高于煙草疫霉病原菌和CK，持續(xù)時(shí)間也高于煙草疫霉病原菌和CK。

2.2 接種菌后煙苗POD活性的變化

由圖2可知，接種煙草疫霉1 d后，煙苗POD活性即達(dá)到最高峰0.5 U/g，是清水對(duì)照的5.7倍。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，活性逐漸降低。在整個(gè)測(cè)定過程中芽孢桿菌1205的酶活始終高于煙草疫霉病原菌，尤其是1 d時(shí)煙苗POD活性即達(dá)到最大值0.557 U/g，遠(yuǎn)高于清水對(duì)照。酶測(cè)定結(jié)果表明，煙苗對(duì)微生物的抗性越強(qiáng)，POD活性越強(qiáng)，持續(xù)的時(shí)間也越強(qiáng)。

2.3 接種菌后煙苗PAL活性的變化

由圖3可知，煙苗接種煙草疫霉病原菌3 d后煙苗PAL活性達(dá)到最高峰0.661 U/g，是清水對(duì)照的2.5倍，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，活性逐漸降低，至接種后11 d時(shí)達(dá)到最低值0.087 U/g，且低于清水對(duì)照。而接種芽孢桿菌1205 5 d后，PAL活性均顯著高于煙草疫霉病原菌和CK且達(dá)到峰值0.73 U/g，是CK的1.23倍，是接種煙草疫霉病原菌的1.17倍，持續(xù)時(shí)間也遠(yuǎn)高于清水對(duì)照和接種煙草疫霉病原菌。

3 小結(jié)與討論

過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL等植物防御酶在植物受到各種病原生物的作用時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生，這些酶通過參與植物抗病次生物質(zhì)（如木質(zhì)素、酚類化合物、植保素）的代謝[13-15]或植物體內(nèi)活性氧AOS代謝，或直接抑制及殺死病原菌等使植物對(duì)病原物具有抗性[16]。多數(shù)研究表明，POD、PPO、PAL等酶的活性與抗病指數(shù)呈正相關(guān)，是植物抵抗病原菌侵害的一種特殊保護(hù)性反應(yīng)，因?yàn)榭共≈仓昝富钚韵鄬?duì)高于感病植株[17]，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。在本試驗(yàn)中病原菌和芽孢桿菌1 205均能引起煙苗中3種防御酶活性的升高，只是活性程度與活性峰值產(chǎn)生的時(shí)間有所差異。經(jīng)病原菌處理的煙苗PAL和 PPO酶活性最高峰出現(xiàn)在接種后3 d ，而經(jīng)芽孢桿菌1205處理后煙苗內(nèi)PAL和PPO酶活性最高峰出現(xiàn)在接種后5 d。在第1天接種芽孢桿菌和煙草疫霉后的POD活性均達(dá)到最高值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)芽孢桿菌1205處理后的煙苗的POD、PPO、PAL活性均普遍高于煙草疫霉處理的煙苗。

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