溫度對蛹蟲草菌絲及子實體生長的影響

摘要：以優(yōu)質(zhì)蛹蟲草（Cordycps militaris Link）液體菌種為栽培種，分別以12、16、20、24、28 ℃ 5個不同溫度處理對蛹蟲草的發(fā)菌、轉(zhuǎn)色、原基分化、子實體生長等主要生長階段進行單因子對照試驗，通過比較各溫度處理的菌絲及子實體形態(tài)、色澤、生長趨勢、產(chǎn)量、質(zhì)量的變化，并以實際栽培產(chǎn)量及商品性能為主要指標，探索蛹蟲草不同生長階段適宜培養(yǎng)溫度及生長規(guī)律。結(jié)果表明，當培養(yǎng)溫度分別為16～20、20～24、20、20 ℃時，蛹蟲草各生長階段的生長性能優(yōu)良，生產(chǎn)周期較短，出草產(chǎn)量較高。說明蛹蟲草菌絲及子實體生長對溫度十分敏感，實行變溫管理是提高蛹蟲草產(chǎn)量與質(zhì)量的有效措施。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草（Cordycps militaris Link）；溫度；產(chǎn)量

中圖分類號：S567.3+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0385-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.030

蛹蟲草（Cordycps militaris Link）又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬真菌界（Fungi）、雙核菌亞界（Bikarya）、子囊菌門（Ascomycota）、子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps Link）模式種[1]。近年來的眾多研究證實，蛹蟲草不僅含有人體必需的8種氨基酸，且比例適宜、含量豐富，還含有其他有益的氨基酸及微量元素、維生素等多種營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價值；尤其是主要活性成分蟲草酸、蟲草多糖、超氧化物歧化酶、腺苷等含量接近或略高于天然的冬蟲夏草[2，3]，并且蟲草素含量也顯著高于天然冬蟲夏草，被認為是天然冬蟲夏草的理想替代品及藥用真菌資源中的后起之秀[3]，其對消除疲勞、緩解緊張、提高人體免疫力以及預(yù)防和治療各類腫瘤、慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心腦血管病、腎炎腎衰、腎功能障礙等疾病具有較好的功效[2-4]。所以開發(fā)利用蛹蟲草資源具有重要的理論和實際意義。

子實體的人工栽培是蟲草資源開發(fā)利用的主要途徑，實踐證明，溫度是影響蛹蟲草菌絲及子實體生長的重要因素之一，是栽培實踐中不出草、出劣質(zhì)草或產(chǎn)量低下的常見原因之一[5，6]。為此，試驗就溫度對蛹蟲草菌絲及子實體生長的影響進行了較深入的探討，以期為蛹蟲草人工規(guī)范化栽培提供一定的理論依據(jù)及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草液體菌種D1由荊楚理工學院食用菌實驗室分離、保藏、提供，并經(jīng)出草栽培試驗證實具有較好的出草性能。

1.1.2 原料 馬鈴薯和蠶蛹粉從市場購買，可溶性淀粉、蛋白胨、瓊脂為實驗室已備，葡萄糖（化學純）為天津福晨化學試劑廠生產(chǎn)，磷酸二氫鉀和硫酸鎂（化學純）為天津凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品、維生素B1為華中藥業(yè)公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 主要有YX-400A高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、FA2104分析電子天平（上海良平儀器有限公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、TP22恒溫搖床（中國科學院武漢科學儀器廠）、HP1500GS型智能人工氣候箱（武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司）、LRH-250-GSⅠ型智能人工氣候箱（廣東韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司），250B生化培養(yǎng)箱（江蘇金壇醫(yī)療器械廠）等。

1.1.4 培養(yǎng)基 菌絲生長及轉(zhuǎn)色性能測定使用改良PDA培養(yǎng)基[7]（去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，VB1 10 mg，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然），栽培岀草采用大米培養(yǎng)基[7]（大米30 g，營養(yǎng)液45 mL；其中營養(yǎng)液配方為：蠶蛹粉30 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，維生素B1 10 mg ，水1 000 mL，pH 7.5）。上述改良PDA培養(yǎng)基用培養(yǎng)皿（直徑80 mm）制為平板，出草培養(yǎng)基以500 mL罐頭瓶為培養(yǎng)容器，按常規(guī)高壓蒸汽滅菌法消毒。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長 將蛹蟲草菌種經(jīng)活化處理后接入液體菌種培養(yǎng)基中，于20 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)至液體菌種成熟[8，9]。以無菌移液槍取液體菌種0.1 mL，點種于改良PDA平板培養(yǎng)基中央。采用單因子對照試驗方法，分別設(shè)置12、16、20、24、28 ℃5種恒溫處理，避光培養(yǎng)10 d，每個處理10個培養(yǎng)皿（重復(fù)10次），比較觀察各處理的菌絲形態(tài)、生長趨勢、生長速度等差異，總結(jié)不同溫度對蛹蟲草菌絲生長的影響、規(guī)律及特點。

1.2.2 轉(zhuǎn)色性能測定 從避光培養(yǎng)菌落中選取最佳者，分別在12、16、20、24、28 ℃溫度下光照培養(yǎng)，比較觀察各處理的菌絲完成轉(zhuǎn)色的時間、轉(zhuǎn)色程度、轉(zhuǎn)色狀況及菌絲生長趨勢等，并以實驗室常見的良好轉(zhuǎn)色情況為對照，每個處理10個培養(yǎng)皿（重復(fù)10次），分析探討不同溫度對蛹蟲草平板菌絲生長、發(fā)育、轉(zhuǎn)色的作用規(guī)律及特點。

1.2.3 栽培出草試驗 另取液體菌種，按約10%的比例接入栽培出草培養(yǎng)基中，在適宜的光照、濕度等條件下[5，6]，分別設(shè)置12、16、20、24、28 ℃5種白晝溫度處理條件進行發(fā)菌、轉(zhuǎn)色、原基分化及出草等各階段的栽培出草試驗（其他階段試驗溫度均為20 ℃），每個處理20個罐頭瓶（重復(fù)20次），比較觀察不同溫度條件處理下菌種萌發(fā)、菌絲形態(tài)、轉(zhuǎn)色、子座形成、出草、子實體產(chǎn)量及形態(tài)等特征，并以是否出草及草體產(chǎn)量、形態(tài)等為主要指標，分析研究不同溫度條件對蛹蟲草菌絲發(fā)菌、生長、轉(zhuǎn)色、發(fā)育及出草等方面的影響規(guī)律，其中各處理子實體原基分化晝夜溫差為夜間溫度較白晝降低5 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對蛹蟲草平板菌絲體生長及形態(tài)的影響

菌絲及其細胞在避光條件下從營養(yǎng)基質(zhì)中吸收相關(guān)營養(yǎng)，不斷進行生長及發(fā)育并形成菌絲體，從而表現(xiàn)出一定形態(tài)及生長特性是蛹蟲草營養(yǎng)生長階段性能的主要特征，菌絲潔白、濃密、健壯、匍匐狀是蛹蟲草菌絲及細胞具有良好生長發(fā)育性能的重要體現(xiàn)[8，10]。不同溫度處理對蛹蟲草平板菌絲形態(tài)、色澤、生長速度等的影響情況見表1、圖1。從表1可以看出，不同溫度處理對蛹蟲草平板菌絲體生長及形態(tài)有較大的影響。當溫度為12、16、20 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生長速度明顯加快，在16～20 ℃時可保持潔白、健壯、匍匐狀等正常性狀，說明此溫度階段菌絲細胞能保持較旺盛的生長能力。而在12 ℃培養(yǎng)時的菌絲較瘦弱、色澤較暗，菌絲性能已有一定程度的下降，顯然是低溫導(dǎo)致菌絲細胞代謝障礙所致[11-13]。當溫度處理為24 ℃時，菌絲生長速度雖然繼續(xù)有所上升，且仍保持潔白、濃密、匍匐狀，但菌絲性能已表現(xiàn)出一定的減弱趨勢。至28 ℃時，菌絲形態(tài)及性能已明顯下降；說明過高溫度易導(dǎo)致代謝不正常[13]，細胞性能退化。顯示出培養(yǎng)溫度為20 ℃時平板菌絲性能及生長速度均較佳。進一步從圖1可以看出，菌絲生長速度在12～16 ℃區(qū)間上升較快，可以預(yù)測更低溫度下菌絲及細胞代謝將更加緩慢[11]，提示當菌絲細胞經(jīng)過良好培養(yǎng)而置于較低溫度條件下進行保存，可較好地保持菌絲細胞的性能，反映出低溫有利于菌種及菌株的保藏。

2.2 不同溫度對蛹蟲草平板菌絲轉(zhuǎn)色性能的影響

轉(zhuǎn)色是蛹蟲草菌絲由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)為生殖生長、相關(guān)基因順利表達以及相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生與積累的重要標志[14]，能否轉(zhuǎn)色、轉(zhuǎn)色快慢、轉(zhuǎn)色深淺是能否進入生殖生長及出草能力強弱的重要體現(xiàn)[7]，光照培養(yǎng)轉(zhuǎn)色深、轉(zhuǎn)色快是蛹蟲草菌絲細胞具有良好出草性能的重要特征[15]。不同溫度處理對蛹蟲草平板菌絲轉(zhuǎn)色的影響情況見表2。從表2可以看出，不同溫度處理對菌絲轉(zhuǎn)色性能影響明顯，其中20～24 ℃溫度條件下菌絲轉(zhuǎn)色深、轉(zhuǎn)色快，菌絲濃密，匍匐健壯，轉(zhuǎn)色性能最好；16 ℃處理的次之；12、28 ℃處理的依次最差；24、20、16、12、28 ℃處理的平板菌絲色澤分別為橙黃、橙黃、黃、淺黃、淡黃，菌絲顏色差別明顯，且16、12 ℃處理的菌絲密度逐漸稀疏、瘦弱，轉(zhuǎn)色能力依次減弱，說明低溫可抑制和影響蛹蟲草菌絲的轉(zhuǎn)色性能發(fā)揮；28 ℃的菌絲僅轉(zhuǎn)為淡黃色，菌絲稀疏、氣生菌絲生長較旺，菌絲色澤、菌絲形態(tài)、生長趨勢等較16、12 ℃處理的進一步下降，反映出蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色受高溫的影響更為明顯，從而導(dǎo)致保持和延續(xù)菌絲良好性能的適宜溫度較窄。此外，試驗中還觀察到，光照下各平板菌落直徑增加較少，說明光照對蛹蟲草菌絲生長有較強的抑制作用；同時，28 ℃處理的菌落形態(tài)均由原來的濃密、匍匐狀轉(zhuǎn)變?yōu)橄∈杓皻馍L，且表現(xiàn)較明顯，表明菌絲細胞性能已發(fā)生較明顯的改變[16]。這個結(jié)果證明轉(zhuǎn)色階段適宜的溫度是延續(xù)和保持蛹蟲草菌絲細胞良好性能的重要條件之一。

2.3 不同溫度對蛹蟲草栽培發(fā)菌生長的影響

以不同溫度條件模擬實際栽培過程，進而全面了解溫度變化對蛹蟲草菌絲生長、發(fā)育及出草結(jié)果的影響，是全面反映溫度條件與菌絲及細胞性能、出草結(jié)果相互關(guān)系及其規(guī)律的根本手段和方法[15-17]。不同溫度處理對栽培蛹蟲草菌瓶發(fā)菌及菌絲形態(tài)的影響結(jié)果見表3。從表3可見，20、24 ℃條件下菌絲的發(fā)菌時間、滿瓶時間均較短，菌絲潔白、濃密、匍匐狀，出草子座形態(tài)典型，但產(chǎn)量是20 ℃處理高于24 ℃處理約1.9 g/瓶。28 ℃處理盡管發(fā)菌較快，但滿瓶時間較長、菌絲稀疏淺白，子實體較細小，產(chǎn)量比20 ℃處理低9.4 g/瓶。16 ℃處理發(fā)菌時間亦較短，菌絲潔白、濃密、匍匐狀，出草子座較粗壯，產(chǎn)量亦略高于20 ℃處理。12 ℃處理的發(fā)菌時間分別較20、16 ℃處理延長2.0、1.5 d，滿瓶時間分別較20、16 ℃處理延長8、6 d，菌絲亦較稀疏，子座較粗矮，數(shù)量較少，產(chǎn)量分別比20、16、24 ℃處理減少7.8、8.5、5.9 g/瓶。因為在溫度適度較低時，菌絲生長速率雖有所降低，但更有利于菌絲細胞營養(yǎng)物質(zhì)的積累和菌絲生物量的增加[12，13]，從而有利于菌絲后期發(fā)育、出草及增加產(chǎn)量。試驗結(jié)果說明蛹蟲草發(fā)菌以16～20 ℃最為適宜，16～24 ℃也可較好地保持出草性能，這個結(jié)果與表1及圖1的情況較為一致。

2.4 不同溫度對蛹蟲草栽培轉(zhuǎn)色的影響

不同溫度處理對蛹蟲草栽培轉(zhuǎn)色的影響情況見表4。從表4可見，處理溫度為24、20 ℃時，蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色至橙黃色，轉(zhuǎn)色時間短，發(fā)出的草體形態(tài)典型，產(chǎn)量均較高，依次為18.2、16.9 g/瓶；而16、28 ℃條件下轉(zhuǎn)色狀況較24、20 ℃處理均較差，產(chǎn)量也明顯降低，其中16 ℃處理的轉(zhuǎn)色較28 ℃處理好一些，菌絲較濃密、較健壯、匍匐狀，出草子座盡管較少，但粗矮，產(chǎn)量亦較28 ℃處理高4.1 g/瓶；12 ℃處理可轉(zhuǎn)色至淺黃，但菌絲稀疏瘦弱，不能出草。綜合表1、表2、表3的情況可知，蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色的適宜溫度比其發(fā)菌、菌絲體生長等營養(yǎng)生長階段要高，且適宜溫度范圍趨于狹窄，可能與蛹蟲草不同的生長發(fā)育過程及代謝途徑有關(guān)[12，13]。說明蛹蟲草轉(zhuǎn)色溫度以24 ℃為佳，以20～24 ℃較為適宜。

2.5 不同白晝溫度對蛹蟲草子實體原基分化及子實體生長的影響

以一定溫度及溫差刺激已完成轉(zhuǎn)色菌絲扭結(jié)并形成子實體原基是蛹蟲草生長發(fā)育史中重要和關(guān)鍵的步驟之一，不同白晝溫度處理對蛹蟲草栽培子實體原基分化的影響情況見表5。從表5可見， 20 ℃處理的子實體原基分化形成最快，原基數(shù)量最多、分布均勻、生長趨勢好，子實體產(chǎn)量最高，達到18.4 g/瓶；而12 ℃處理不能形成子實體原基，28、16 ℃處理形成的原基明顯較少，且分化時間較長，產(chǎn)量顯著較低；盡管24 ℃處理可獲得較高的產(chǎn)量，但產(chǎn)量比20 ℃處理明顯低約3.5 g/瓶，說明栽培出草過程中適當控制刺激溫度對子實體原基分化有重要的影響，并以白晝約20 ℃最為適宜。

不同溫度對子實體生長及產(chǎn)量的影響情況見表6、圖2。從表6、圖2及試驗過程中發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草子座形成后，在28、24 ℃等較高溫度下生長很快， 只需11～15 d頂端即可膨大， 但子實體較細小、長度較短，其中28 ℃處理尤其突出，產(chǎn)量明顯降低，商品性能差，說明28 ℃及其以上的高溫不利于子實體的生長和發(fā)育。20 ℃處理亦生長較快，且子實體形態(tài)典型，產(chǎn)量較高，可達17.9 g/瓶，這有利于縮短生產(chǎn)周期。當溫度為16、12 ℃時，且隨著溫度的下降，子實體生長速度顯著降低，如12 ℃處理的子實體成熟時間可達55～60 d，但子實體可明顯增粗、長度增加，子座頂端與下部基本等粗、長度可達10～11 cm，因而產(chǎn)量亦有較明顯的增加，商品性能及銷售價格也有一定程度的提高。結(jié)合表5、表6及圖2結(jié)果可以設(shè)想，以20 ℃及晝夜溫差5 ℃條件刺激子實體原基，使其迅速分化形成，升溫至24 ℃促進原基迅速生長至一定大小后，適當降溫至20、16 ℃，以降低子座的生長速度，促進子實體增粗及增加長度，從而提高子實體個體體積及商品價值。

3 小結(jié)與討論

蛹蟲草人工栽培可分為發(fā)菌及菌絲體生長、轉(zhuǎn)色、原基分化、子實體生長等幾個階段。試驗結(jié)果顯示，蛹蟲草發(fā)菌及菌絲體生長、轉(zhuǎn)色、原基分化、子實體生長各階段培養(yǎng)溫度分別以16～20、20～24、20、20 ℃為宜。其中，在發(fā)菌階段，培養(yǎng)溫度16～20 ℃可較好地滿足菌絲體生長及發(fā)育的要求，溫度過高可導(dǎo)致菌絲細胞性能明顯退化，適當?shù)牡蜏乜纱龠M菌絲積累營養(yǎng)、提高出草產(chǎn)量；在轉(zhuǎn)色階段，培養(yǎng)溫度以20～24 ℃較為適宜，過高或過低可顯著影響菌絲性能，甚至完全不能出草。原基分化是子實體生長及保證良好出草的重要前提，試驗里以白晝20 ℃、晝夜溫差5 ℃為最佳原基分化溫度處理，此條件下原基形成快、數(shù)量多、分布均勻、生長趨勢好，而24 ℃處理的表現(xiàn)次之，至于低溫及高溫則顯著抑制原基分化，說明調(diào)控好此階段溫度及范圍尤為重要，這與王蘭珍等[18]的研究結(jié)果相吻合。子實體生長階段是提高蛹蟲草產(chǎn)量及商品價值的關(guān)鍵時期，在24～28 ℃等較高溫度下，子實體生長迅速，但產(chǎn)量低、形態(tài)細小、商品性較差；而溫度較低后，子實體生長緩慢，但明顯增粗，長度也增加，產(chǎn)量及商品性能亦隨之提高。綜合產(chǎn)量、商品性能及縮短種植周期等因素全面考慮，以20 ℃最佳。總的來看，試驗研究結(jié)果與秦俊哲等[19]、杜雙田等[20]的部分研究較為一致，因此人工種植蛹蟲草實行春秋兩季種植，可以充分利用自然環(huán)境的溫度及氣候條件，降低生產(chǎn)成本，從而獲得較高的經(jīng)濟收益。

試驗結(jié)果進一步說明蛹蟲草屬于中低溫菌類，其菌絲及子實體生長對溫度十分敏感，微小溫度變化即可導(dǎo)致較大的不良生長后果；生產(chǎn)上采取適當?shù)淖儨卦耘喾绞剑翘岣哂枷x草人工栽培產(chǎn)量及效益的重要途徑之一。栽培實踐中，可根據(jù)上述研究結(jié)果，在發(fā)菌階段適當采用較低的培育溫度，促進菌絲發(fā)育，重點滿足和控制好轉(zhuǎn)色、原基分化、子實體生長等重要環(huán)節(jié)對栽培環(huán)境溫度的要求，進而縮短生產(chǎn)周期、提高栽培出草率及產(chǎn)量、質(zhì)量，最終提高經(jīng)濟效益。試驗中還觀察到，適時及良好轉(zhuǎn)色則原基形成早、數(shù)量多、分布均勻、出草整齊、產(chǎn)量高；反之則可影響原基形成、降低產(chǎn)量。

本試驗刺激原基分化以晝夜5 ℃的溫差水平實施，王蘭珍等[18]、秦俊哲等[19]研究認為，原基分化以8～10 ℃的溫差效果最好，這提示我們還可增大溫差以進一步提高原基分化的效果；當然也不排除系菌株不同所導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的結(jié)果。筆者在栽培實踐中，以5 ℃左右的溫差即可取得較好的效果，且易于操作，種植戶可根據(jù)菌株特性來參考借鑒。

致謝：談 晶、向 娜、潘心宇、袁笑譜、曾 東等同學為試驗完成付出了大量心血，在此深表感謝。

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