正交試驗(yàn)對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的優(yōu)化

摘要：以恩施富硒植物續(xù)斷（Dipsacales）為原料，采用微波輔助水浴浸提方法提取其硒多糖，在分析單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化了續(xù)斷硒多糖的提取工藝，并以硫酸-苯酚法測(cè)定續(xù)斷中的硒多糖含量，以原子熒光法檢測(cè)硒多糖的含硒量。結(jié)果表明，續(xù)斷硒多糖最佳的提取條件為微波功率800 W處理6 min、料液比1∶100（g∶mL）、水浴浸提時(shí)間80 min。在此條件下，測(cè)得續(xù)斷中的硒多糖含量為3.38%，硒多糖中的硒含量為1.120 μg/g。

關(guān)鍵詞：續(xù)斷（Dipsacales）；硒多糖；提取分離；正交優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S567.23+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）02-0441-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.045

續(xù)斷又名川斷、接骨草等，是川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（Dipsacales）的干燥根，主要產(chǎn)于湖北、四川、湖南、貴州，在臨床上主要用于治療腰膝酸軟、跌打損傷、骨折、腰椎骨質(zhì)增生、先兆性流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等癥狀[1]。續(xù)斷作為道地的野生藥材，其藥效高，副作用小，因此，作為衛(wèi)生部門規(guī)定的藥食同用品種，續(xù)斷在保健和功能食品中有著良好的應(yīng)有前景[2]。另一方面，國(guó)內(nèi)外對(duì)硒多糖的研究還處于起步階段[3]，硒多糖的全部特性和相關(guān)的生化特征尚未完全研究清楚，但通過最近幾年對(duì)硒多糖的研究，人們也逐步了解了硒多糖的相關(guān)功能，并且，人們對(duì)硒多糖的研究?jī)A向于其藥理作用，如抗骨質(zhì)疏松作用、降血糖血脂作用、抗癌抗氧化性等[4]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)自身的健康越來越關(guān)注，而從植物中提取的硒多糖因其毒副作用小、安全性高，使其在保健或藥物方面的開發(fā)利用具有十分重要的意義。本試驗(yàn)以恩施高硒地區(qū)的道地藥材續(xù)斷為原料，探求續(xù)斷硒多糖的提取工藝，以期為開發(fā)利用恩施藥用植物資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、葡萄糖、乙醚、無水乙醇均為AR；測(cè)硒所用到的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）來源于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

FA1004B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；G80w 23CSL-F9（SO）型微波爐，廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司；HWS26型數(shù)顯恒溫水浴鍋、GXZ-9140型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TDL-80-2B型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WFJ 7200型可見分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 2-4 LSC型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Marin Christ 公司；SH220型石墨消解儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；AFS-930d型原子熒光光度計(jì)，北京吉天儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 續(xù)斷標(biāo)準(zhǔn)粉的制備 將續(xù)斷樣品用自來水洗凈，用二次蒸餾水沖洗，在60 ℃烘箱中烘干，磨粉過60目篩，得標(biāo)準(zhǔn)粉，于干燥器內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 續(xù)斷中硒多糖提取及其含量的測(cè)定 以水提醇沉法[5]來提取樣品中的硒多糖，各單因素試驗(yàn)均采用硫酸苯酚法[6]來測(cè)定樣品中硒多糖的含量。稱取續(xù)斷樣品0.5 g，固定微波功率為800 W，以不同的料液比，經(jīng)不同時(shí)間的微波處理后，于95 ℃恒溫水浴浸提一段時(shí)間，冷卻至室溫，在4 000 r/min條件下離心處理15 min。取上清液于50 mL容量瓶中定容，充分混勻。取該溶液3.0 mL于三角瓶中，加入5倍量的酒精搖勻后靜置過夜，在4 000 r/min條件下離心15 min得續(xù)斷硒多糖，將所得的硒多糖用10 mL蒸餾水溶解，取2.0 mL于試管中，加入6%苯酚1.0 mL，搖勻后迅速滴加濃硫酸5.0 mL，冷卻至室溫后在490 nm處測(cè)定吸光度。參照文獻(xiàn)[7]所述方法，以葡萄糖濃度c（μg/L）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：A=13.698c-0.152（R2=0.999 1），根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可由待測(cè)樣的吸光度計(jì)算出樣品的硒多糖含量。

1.2.3 續(xù)斷硒多糖中硒含量的測(cè)定 試驗(yàn)采用原子熒光光度法[8]測(cè)定續(xù)斷硒多糖的含硒量。稱取續(xù)斷硒多糖0.1 g于消化管中，加入5.0 mL硝酸、2.0 mL雙氧水，在石墨爐中180 ℃消解4 h，至溶液呈清亮透明狀。將溶液蒸發(fā)至1～2 mL左右，加入6 mol/L HCl 2.0 mL還原，反應(yīng)10 min，用5%鹽酸定容至25 mL容量瓶后即可用原子熒光光度計(jì)測(cè)定。待測(cè)樣中硒含量在0.01 ng/mL～0.3 μg/mL的濃度范圍內(nèi)其熒光強(qiáng)度與硒含量成正比[9，10]。因此，以硒濃度c（μg/L）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（I）為縱坐標(biāo)繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：I=110.769 1c+7.303 3（R2=0.999 9），根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，可由待測(cè)樣的熒光強(qiáng)度計(jì)算出樣品的硒含量。

1.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)“1.2.2”所述方法，分別以料液比（g∶mL，下同）、水浴浸提時(shí)間以及微波處理時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，判斷這3種因素對(duì)提取續(xù)斷硒多糖的影響，從而確定后續(xù)正交試驗(yàn)的水平。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)如下正交試驗(yàn)因素與水平（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響 根據(jù)“1.2.2”所述方法，固定料液比1∶40，水浴浸提時(shí)間為40 min，分別在微波處理時(shí)間為2、3、4、5 min條件下研究微波處理時(shí)間對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品吸光度有所增加，但處理后期吸光度的增加并不明顯，綜合考慮提取效率及其他因素，微波處理時(shí)間為5 min較適宜。

2.1.2 料液比對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響 根據(jù)“1.2.2”所述方法，固定微波處理時(shí)間為2 min，水浴浸提時(shí)間為40 min，分別在料液比為1∶20、1∶40、1∶60、1∶80條件下研究料液比對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著溶劑的增加，吸光度也隨之增加，料液比達(dá)到1∶80時(shí)，吸光度增加相對(duì)較緩。考慮后續(xù)濃縮等步驟，料液比以1∶80較適宜。

2.1.3 水浴浸提時(shí)間對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響 根據(jù)“1.2.2”所述方法，固定料液比1∶40，微波處理時(shí)間為2 min，分別在水浴浸提時(shí)間為40、60、80、100 min條件下研究水浴浸提時(shí)間對(duì)續(xù)斷硒多糖提取的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在40～80 min這段時(shí)間內(nèi)，隨著水浴浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，硒多糖的溶出量逐漸增加。長(zhǎng)時(shí)間的水浴會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，因此確定水浴浸提時(shí)間為80 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，方差分析結(jié)果見表2、表3。由表3可知， A、B 2因素顯著水平都小于或等于0.05，因素C的顯著水平大于0.05，這表明微波處理時(shí)間和料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，而水浴浸提時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。經(jīng)多重比較可以看出，因素A微波處理時(shí)間的第三水平最好，因素B料液比的第三水平最好，因素C水浴浸提時(shí)間的3個(gè)水平之間差異不顯著，但以第二水平最好，所以A3B3C2即微波處理時(shí)間6 min、料液比1∶100、水浴浸提時(shí)間80 min為優(yōu)化組合。因素C對(duì)硒多糖提取的影響是次要的，且3個(gè)處理差異不顯著，可根據(jù)操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等方面考慮水浴浸提時(shí)間。

3 小結(jié)與討論

本研究前期以微波輔助處理，提取效率高且能耗低，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以探求微波處理時(shí)間、料液比、水浴浸提時(shí)間3因素對(duì)提取續(xù)斷硒多糖的影響，從而對(duì)試驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，料液比及微波處理時(shí)間對(duì)續(xù)斷硒多糖的提取有較顯著的影響，續(xù)斷硒多糖最佳提取工藝條件為微波功率800 W處理6 min、料液比1∶100、水浴浸提時(shí)間80 min。在此條件下，測(cè)得續(xù)斷中硒多糖含量為3.38%，硒多糖中硒含量為1.120 μg/g。本研究?jī)H以續(xù)斷入藥的根部為原料，對(duì)于續(xù)斷植株其他部位硒多糖富集情況尚有待研究。

近年來，人們已經(jīng)對(duì)續(xù)斷的化學(xué)成分做了較為系統(tǒng)的研究[11]，而對(duì)于富硒續(xù)斷中硒多糖的研究并不是很多。已有的大量試驗(yàn)證明，多糖具有復(fù)雜的生物活性，是一種廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，另一方面，由于硒參與機(jī)體中多種酶的組成和代謝過程，因而具有延緩衰老、防癌抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理功能。而硒多糖兼有多糖與硒二者的活性[12]，其生物活性普遍高于多糖和硒且更有利于機(jī)體的吸收和利用，并且從植物中提取的硒多糖由于其天然安全無毒的優(yōu)點(diǎn)，越來越引起人們的重視。本試驗(yàn)以恩施高硒地區(qū)的道地藥材續(xù)斷為原料，探求優(yōu)化續(xù)斷硒多糖的提取工藝，以期為充分利用恩施藥用植物資源提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 全國(guó)中草藥會(huì)編寫組.全國(guó)中草藥匯編（下冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.

[2] 武 蕓，丁 莉，周吉源.五鶴續(xù)斷的研究概況與開發(fā)前景[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004，21（4）：31-33.

[3] 劉振鋒，東 方，季宇彬，等.硒多糖藥理活性研究進(jìn)展[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，25（4）：36-40.

[4] 易春艷.天然富硒植物中硒多糖的提取、分離和初步分析[D].武漢：華中師范大學(xué)， 2006.

[5] 劉 菊，王君明，紀(jì) 彬，等.貓爪草粗多糖提取工藝研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，27（12）：1622-1623.

[6] YAMAMOTO Y， MUROSAKI S， YAMAUCHI R，et al . Structural study on an exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus helveticus TY1-2[J]. Carbohydrate Research，1994， 261（1）：67-78.

[7] 馬 力，徐楚鴻，黃 煜，等.硫酸苯酚法測(cè)定金菊花中多糖的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（12）：1511-1512.

[8] 趙銀寶，王彩艷，茍春林，等.枸杞中微量硒測(cè)定方法[J].中國(guó)農(nóng)林科技，2008（4）：28-29.

[9] 徐翠蓮，杜林洳，樊素芳，等.多糖的提取、分離純化及分析鑒定方法研究[J].河南科學(xué)，2009，27（12）：1524-1529.

[10] 丁在亮.原子熒光法測(cè)定飼料中硒的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[11] 劉二偉，吳 帥，樊官偉.川續(xù)斷化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（7）：1421-1423.

[12] 崔 喬，尚德靜，鄒 霞.硒多糖的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2003，24（3）：155-156.