基質分散萃取—高效液相色譜法對菠菜中噻蟲胺殘留的檢測

摘要：研究確立了乙腈為分散萃取溶劑，以羧基化雙壁碳納米管（DWCNTs-COOH）和石墨化碳黑（GCB）為基質分散材料的菠菜（Spinacia oleracea L.）樣品中噻蟲胺殘留基質分散萃取前處理方法，建立并優化了乙腈等度洗脫的HPLC殘留樣品外標定量方法。結果表明，優化色譜條件下，噻蟲胺標準樣品的色譜保留時間為6.258 min，在0.05～100 mg/L范圍內與對應色譜峰積分面積線性響應良好，回歸方程為y=4.948 2x-1.316 9（R2=0.999 7），噻蟲胺在菠菜樣品中0.1、0.5和5.0 mg/kg 3個水平的添加回收率均在85%以上，各添加水平的相對標準偏差均小于7%，該色譜條件下儀器檢出限為0.052 7 μg/L，方法的最低檢測量為0.015 mg/kg。表明該殘留樣本前處理方法和樣品檢測方法簡便、高效、經濟、可靠，可滿足噻蟲胺在菠菜中的殘留定量檢測要求。

關鍵詞：基質分散萃取；碳納米管；菠菜（Spinacia oleracea L.）；噻蟲胺；高效液相色譜法

中圖分類號：O657.7+2；S636.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0465-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.051

噻蟲胺（Clothianidin）是1996年日本武田公司開發的具噻唑環的第二代新煙堿類內吸殺蟲劑[1]，其化學名是1-（2-氯-1，3-噻唑-5基甲基）-3-甲基-2-硝基胍，分子式為C6H8ClN5O2S。噻蟲胺的水溶性較好，易溶于丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑中。噻蟲胺和其他煙堿類化合物一樣，均以乙酰膽堿受體（AchR）為分子靶標，通過影響昆蟲神經沖動的正常傳導，導致昆蟲出現異常興奮而死亡[2]。該藥劑高效、廣譜，兼具內吸、觸殺和胃毒作用，對半翅目、鱗翅目、鞘翅目及雙翅目害蟲等均有較高的防效[3，4]。噻蟲胺作用機制新穎、應用方式多樣化、防效優良，已經成為農業生產中具有廣泛用途的殺蟲劑。但目前噻蟲胺不科學合理使用的現象比比皆是，如為達到短期防效盲目加大施藥量，施藥后沒有達到安全采收間隔期采收上市等，因此，農產品中噻蟲胺含量超標現象時有發生。

有關蔬菜中噻蟲胺殘留樣本的前處理技術主要包括乙腈勻漿提取-硅膠小柱固相萃取凈化[5-7]和乙腈勻漿提取-基質分散萃取[8]，樣品檢測技術方面主要集中在液相色譜和液質聯用方面。縱觀已報道的葉菜類蔬菜中噻蟲胺殘留分析技術的報道，均不同程度地存在著樣品處理程序繁瑣和需要借助價格昂貴的檢測儀器等問題。

碳納米管（CNTs）是1991年日本NEC公司的Iijima[9]利用真空電弧蒸發石墨電極法制備富勒烯中發現的一種具有納米尺寸和完整分子結構的碳管狀物，具有比表面積大、孔徑豐富、孔結構適宜和穩定性良好等特性，是一種性能優良的納米級吸附材料，其應用已受到科研人員的廣泛關注，目前已有較多關于其應用于農藥殘留分析樣品制備方面的報道。汪雨等[10]利用多壁碳納米管（MWCNTs）作為固定相，萃取水中有機氯農藥和多氯聯苯的過程發現，與傳統吸附材料相比，具有萃取時間短、消耗溶劑少和效果優異等特點。Zhou等[11]用MWCNTs作為固相萃取（SPE）填料，成功建立了環境水中氰草津、綠麥隆和滅幼脲的殘留樣本前處理方法。Min等[12]以單壁碳納米管（SWCNTs）為SPE填料研究了水和土壤中阿特拉津及其降解物的萃取性能，結果顯示SWCNTs的富集效率優于C18和GCB。官金艷[13]在對茶葉中4種磺酰脲類除草劑前處理過程中引入CNTs作為輔助凈化劑，有效解決了傳統分散萃取材料萃取過程中出現的回收率低和基質干擾嚴重等問題。王磊等[14]研究了經過化學修飾的MWNTs對阿特拉津的吸附和解吸附特性，發現3種MWNTs對阿特拉津的吸附能力依次為MWNTs-COOH>MWNTs-OH>MWNTs，且阿特拉津可從3種MWNTs上完全解吸，均無解吸滯后現象。Fang等[15]系統比較了MWCNTs、C18和硅藻土對蘋果和西紅柿樣本中31種農藥的萃取效果，結果顯示其萃取效果整體上優于C18和硅藻土。

基質分散萃取是在基質分散固相萃取技術基礎上開發的一種新穎、快速殘留樣品前處理方法[16]。該技術集樣品均質化、提取、凈化于一體，操作簡單、快速、試劑用量小，最大限度地避免了樣品中殘留農藥的損失和樣品基質效應的影響，該方法已經得到AOAC和歐盟農藥殘留檢測委員會認可，并已大量應用于農藥殘留分析[17-20]。

利用簡單的樣品前處理方法和成本較低的檢測手段獲得結果準確度高、數據重現性好和靈敏度高的檢測結果是目前農藥殘留研究者的共同追求。本研究試圖通過對傳統基質分散萃取技術的改進，引入碳納米管作為主要基質分散、凈化材料，建立具有快速、簡單、廉價、有效、可靠，安全等特點的常見葉菜類蔬菜中噻蟲胺殘留樣品的前處理程序和基于簡單色譜儀器、符合農藥殘留分析要求和能夠滿足相關農藥殘留限量標準的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和材料

Agilengt 1260 HPLC-UVD（帶自動進樣器），Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）分離分析柱，KH19A型醫用離心機（湖南凱達科學儀器有限公司），TDL5000型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠制造），IKA VORTEX GENIUS3型渦旋混合器（德國IKA公司）、FA1008B型電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、YP5002型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、ZK型高速自控組織搗碎機（江蘇省鹽城縣龍崗醫療機械廠）。

氯化鈉（天津市福晨化學試劑廠），色譜級甲醇、乙腈（天津市光復精細化工研究所），分析級乙腈（天津市瑞金特化學品有限公司），羧基化雙壁碳納米管（管徑2～4 nm，長度5～15 μm，純度90%，中科雷鳴科技有限公司），石墨化碳黑（天津博納艾杰爾科技有限公司），純度為99.5%噻蟲胺標準品（中國國家標準物質研究中心）。

菠菜（Spinacia oleracea L.）樣品為河南科技學院農藥學實驗室栽種。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜檢測條件 色譜柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：V1（色譜級乙腈）∶V2（含5 mmol/L的乙酸胺水溶液）=45∶55；流動相流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：265 nm；進樣量：5 μL。

1.2.2 標準曲線繪制 準確稱取噻蟲胺標準品5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用色譜級乙腈定容，配制成100 mg/L的噻蟲胺標準樣品儲備液，然后用色譜級乙腈逐級稀釋，配制成質量濃度分別為0.025、0.1、0.5、1、5、10、50和100 mg/L噻蟲胺標準樣品工作液，在確定的色譜條件下，分別對所配制的噻蟲胺系列濃度的標準樣品進行色譜測定，以色譜峰積分面積（mAU·s）為縱坐標，以進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程及相關系數，并計算方法的最低檢出限（LOD）。

1.2.3 樣品前處理 首先將實驗室栽種的菠菜在高速組織搗碎機中以20 000 r/min勻漿、均質化，然后準確稱取均質化勻漿物5.0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入10 mL分析級乙腈，高速渦旋5 min，加入2 g氯化鈉，再渦旋3 min，然后以5 000 r/min離心5 min，用移液器小心移取上清液2 mL于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，同時加入5 mg的羧基化雙壁碳納米管和10.0 mg石墨化碳黑，渦旋3 min，再以10 000 r/min離心5 min，移取上清液1 mL，過0.22 μm濾膜至進樣小瓶，待測。

1.2.4 樣品添加回收率 將配制好的噻蟲胺標準溶液按照0.1、0.5和5.0 mg/kg 3個添加水平分別加入到菠菜空白樣品中進行添加回收率試驗，采用與“1.2.2”完全相同的方法進行樣品前處理，并采用最終優化好的色譜條件進行色譜檢測，測定各添加水平樣品的回收率，并計算各添加水平的相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 色譜分析條件

試驗發現，采用Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫40 ℃；流動相為V1（色譜級乙腈）∶V2液（含5 mmol/L乙酸胺水溶液）=45∶55，流動相流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為265 nm，進樣量為5 μL，可獲得菠菜樣品基質中噻蟲胺穩定、良好的分離效果。圖1為采用上述色譜檢測條件對樣品的檢測結果。由圖1可以看出，噻蟲胺標準樣品的出峰時間為6.258 min，峰形良好，且與菠菜樣品基質無干擾。

2.2 標準曲線的制作

噻蟲胺在確定色譜條件下的線性響應見圖2。由圖2可以看出，噻蟲胺在0.05～100 mg/L樣品濃度與色譜峰積分面積響應值之間具有良好的線性關系，回歸方程為y=4.948 2x-1.316 9（R2=0.999 7）。以3倍S/N的計算方法得LOD為0.052 7 μg/L。

2.3 方法的準確度與精密度

采用模擬添加法，分別對菠菜空白樣品做0.1、0.5和5.0 mg/kg 3個水平的添加回收率，各做3次重復，檢測并計算各添加水平的回收率和及相對標準偏差（RSD），結果見表1。從表1可以看出，菠菜樣品中噻蟲胺3個添加水平的平均回收率均大于85%，相對標準偏差均小于7%，以10倍的信噪比計算得噻蟲胺在菠菜中的最低檢測限（LOD）為0.015 mg/kg。

3 討論

傳統的基質分散萃取技術核心是樣品經有機溶劑提取、MgSO4鹽析分層和以PSA、C18和GCB等為分散材料的樣品提取液凈化。本研究在色譜方法開發環節分別嘗試運用甲醇、乙腈及不同pH的甲醇、乙腈作為色譜流動相，試驗發現以甲醇作為流動相，噻蟲胺的色譜峰出現嚴重的拖尾現象，而用體積比為45∶55的甲醇和含5 mmol/L的乙酸胺水溶液為流動相，一方面有效改善了色譜峰峰形，另外也在一定程度上提高了檢測靈敏度。為了避免因環境溫度不穩定造成的色譜分離結果的不一致，及因流動相黏度高而造成的色譜柱柱效降低，設定了40 ℃的色譜柱柱溫。在殘留樣品前處理環節，為了達到既能有效去除樣品基質中的干擾性組分，又不致使樣品中的殘留農藥被大量吸附，試驗中對基質分散、凈化材料羧基化雙壁碳納米管和石墨化碳黑的用量效果進行了比較，結果發現5 mg的羧基化雙壁碳納米管和10.0 mg石墨化碳黑是處理一個樣品的最佳用量配比。

綜合來看，根據基質分散萃取的基本原理，采用乙腈作為提取劑、以羧基化雙壁碳納米管和石墨化碳黑為基質分散、凈化材料，建立的菠菜樣品中噻蟲胺殘留的基質分散萃取樣品前處理方法具有操作簡單、溶劑使用量少、提取效果好的特點。確立的以甲醇和乙酸胺水溶液等度洗脫的殘留樣品高效液相色譜檢測技術具有線性檢測范圍寬、重復性好、檢測靈敏度高、實用性強的特點。可以滿足菠菜中噻蟲胺殘留量的分析檢測要求，另外，該方法也為噻蟲胺在菠菜中的殘留測定和殘留規律研究提供了技術支持。

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