石斛內(nèi)生菌SH—1 PQQ基因的克隆與生物信息學(xué)分析

摘要：從石斛內(nèi)生菌變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）SH-1中PCR擴(kuò)增得到吡咯喹啉醌（PQQ）基因，其大小為5 444 bp，包含了pqqABCDEF 6個(gè)基因，并對(duì)PQQ基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為下一步構(gòu)建高效基因工程菌，研究其生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：PQQ基因；變棲克雷伯菌；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）02-0490-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.057

PQQ，學(xué)名為吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone），化學(xué)名稱(chēng)為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，又名Methaxatin，是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷酸之后在細(xì)菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，世界醫(yī)學(xué)界稱(chēng)之為第十四種維生素。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，人們就開(kāi)始對(duì)吡咯喹啉醌（PQQ）的生理生化進(jìn)行了研究。PQQ作為醌蛋白的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，是一種具有多種生理功能的生物活性物質(zhì)[1，2]。PQQ具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、防治肝損傷、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成、調(diào)節(jié)機(jī)體自由基水平（抗氧化）、提高機(jī)體免疫力以及增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)毒性和輻射等極端條件的耐受性等功能，是一種獨(dú)特的生理活性物質(zhì)[3，4]，是動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)因子[5]。目前，能夠以PQQ作為輔基的酶，包括有甲醇脫氫酶（MDH）、乙醇脫氫酶（EDH）、醇脫氫酶（ADH）、葡萄糖脫氫酶（GDH）、聚乙烯醇脫氫酶（PVDH）、奎尼酸脫氫酶（QDH）、果糖脫氫酶（FDH）、聚乙二醇脫氫酶（PGDH）、四氫糠醇脫氫酶（TDH）、山梨（糖）醇脫氫酶（SDH）和羽扇烷寧羥化酶（LUH）等[6]。已知能夠產(chǎn)生PQQ的微生物僅限于某些革蘭氏陰性細(xì)菌，目前尚未明確真核生物能否利用PQQ的醌酶，并且動(dòng)物和植物本身無(wú)法合成PQQ，只是在植物、動(dòng)物包括人體內(nèi)以及多種食物中含有痕量的PQQ，含量與維生素K、生物素相當(dāng)[7-9]。研究還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物主要通過(guò)飲食途徑攝取PQQ[10]。有些細(xì)菌如大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，自身不能合成PQQ，但能產(chǎn)生依賴(lài)PQQ的蛋白質(zhì)（這種蛋白質(zhì)稱(chēng)為脫輔蛋白），在攝取外源PQQ時(shí)能形成有活性的全酶[11]。

PQQ不僅是某些微生物體內(nèi)氧化還原酶的輔助因子，還是一種刺激生長(zhǎng)代謝的營(yíng)養(yǎng)因子。這種刺激主要表現(xiàn)在：①加快菌體的生長(zhǎng)速度和生物產(chǎn)量，但不能縮短其遲緩期；②能顯著地縮短菌體生長(zhǎng)的遲緩期，但對(duì)指數(shù)期的生長(zhǎng)速度和靜止期生物產(chǎn)量沒(méi)有影響[6]。PQQ還能夠顯著增強(qiáng)微生物對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、發(fā)育與繁殖，如縮短植物的花粉萌發(fā)時(shí)間、促進(jìn)種子萌發(fā)、提高脂肪酶活性和種子呼吸速率。PQQ具有很好的電化學(xué)活性和較高的穩(wěn)定性，已經(jīng)用于生物電極上[12]，PQQ的電化學(xué)研究不僅有助于研發(fā)新的擬生態(tài)催化系統(tǒng)，還有助于了解醌酶的催化機(jī)制。在構(gòu)建的幾種細(xì)菌基因文庫(kù)中分別克隆到了與PQQ合成有關(guān)的基因，并經(jīng)序列分析、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，PQQ的生物合成是一個(gè)由5～6步酶促反應(yīng)組成的多步過(guò)程，合成過(guò)程可能涉4～7個(gè)相關(guān)基因：醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）[13]和氧化葡萄糖桿菌（Gluconobacter oxydans）[14]中的pqqABCDE、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）[15]中的pqqABCDEF和外鏈甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）[16]中的pqqABCDEFG，并且這些基因往往是以基因簇的形式存在。

最近研究表明，PQQ也可以消除人體自由基，治療因自由基過(guò)多引發(fā)的胃腸疾病、心腦血管疾病、癌癥等，在抗衰老方面也起著重要的作用[17]。盡管如此，對(duì)于吡咯喹啉醌的分布狀況、產(chǎn)生機(jī)理、結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。本研究利用特異性引物擴(kuò)增并克隆得到PQQ基因，變棲克雷伯菌（K.variicola）的pqq位點(diǎn)的完整核苷酸序列也已經(jīng)找到，并且構(gòu)建了PQQ基因結(jié)構(gòu)圖譜，對(duì)核苷酸序列比對(duì)結(jié)果和相關(guān)生物信息學(xué)分析進(jìn)行了討論，為下一步構(gòu)建PQQ高產(chǎn)菌株，研究PQQ生物合成以及進(jìn)一步推動(dòng)PQQ在食品、輕工、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等方面的應(yīng)用具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為石斛內(nèi)生菌變棲克雷伯菌SH-1（專(zhuān)利號(hào)：ZL201310383464.0，菌株保藏號(hào)：CCTCC M 2013367）[18]。

1.2 DNA提取與目的基因的擴(kuò)增

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB/NaCl法提取細(xì)菌基因組DNA參考文獻(xiàn)[19]。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 以基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增了目的基因。上游引物：5’-GCCTTCTAGAAGTTTTTTTCGCACTGTCG-3’；下游引物：5’-GACTAAGCTTGACAATAGCTGAATTCTCG-3’。PCR擴(kuò)增體系為：10×Long PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，上、下游引物各1 μL，模板 2 μL，Long and Accurate Enzyme 0.25 μL，去離子水 39.75 μL，總體系50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3 序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物直接克隆到載體pGEM-T Easy vector （Promega公司），采用ABI PRISMTM 377 DNA 自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定，序列分析采用SeqMan和MegAlign。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，目的條帶大小約5.4 kb，對(duì)目的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序分析。結(jié)果表明，目的條帶與GenBank中的變棲克雷伯菌DSM 15968（登錄號(hào)為CP010523）PQQ基因相應(yīng)片段序列核苷酸同源性高達(dá)98%，與變棲克雷伯菌DX120E（登錄號(hào)：CP009274）的相應(yīng)片段序列核苷酸同源性達(dá)到97%，與變棲克雷伯菌At-22（登錄號(hào)：CP001891）相應(yīng)片段序列核苷酸同源性達(dá)到97%（表1）。

2.2 PQQ基因生物信息學(xué)分析

5 444 bp的變棲克雷伯菌染色體DNA片段的分子質(zhì)量為194 ku，由1 775 個(gè)氨基酸組成；pqqA基因大小72 bp，推測(cè)編碼由23個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為2.8 ku的蛋白質(zhì)；pqqB基因大小927 bp，推測(cè)編碼由307個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為33 ku的蛋白質(zhì)； pqqC基因大小750 bp，推測(cè)編碼由250個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為27 ku的蛋白質(zhì)；pqqD基因大小279 bp，推測(cè)編碼由93個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為10 ku的蛋白質(zhì)；pqqE基因大小1 130 bp，推測(cè)編碼由374個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為41 ku的蛋白質(zhì)； pqqF基因大小2 286 bp，推測(cè)編碼由753個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為84 ku的蛋白質(zhì)，結(jié)果與Meulenberg等[15]的研究結(jié)果大致相同，且pqqA與pqqB之間存在非編碼區(qū)，大小為54 bp。

2.3 PQQ結(jié)構(gòu)基因圖譜

如圖1可以看出，5 444 bp的變棲克雷伯菌染色體DNA片段編碼的6個(gè)pqq基因。啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄的方向用箭頭表示（位于pqqA的上游）。pqqB與pqqC、pqqD與pqqE都有堿基重疊現(xiàn)象，分別有6 bp和13 bp重疊，本研究結(jié)果與Meulenberg等[15]研究的結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)生物信息學(xué)分析6種PQQ操縱子的分子質(zhì)量以及氨基酸數(shù)分別為pqqA（2.8 ku，23個(gè)氨基酸）、pqqB（33 ku，307 個(gè)氨基酸）、pqqC （27 ku，250個(gè)氨基酸）、pqqD（10 ku，93個(gè)氨基酸）、pqqE（41 ku，374個(gè)氨基酸） 和pqqF（84 ku，753個(gè)氨基酸）。不同來(lái)源的pqq基因都各自組成類(lèi)似的pqq操縱元，但大部分基因之間具有氨基酸序列同源性。簇基因A編碼一個(gè)由22～39個(gè)氨基酸組成的小肽[20]，此小肽可能是PQQ的前體，并具有Glu-Val-Thr-X-Tyr的保守序列[21]，已有試驗(yàn)證明在該段多肽上的谷氨酸和酪氨酸殘基是必需的[22]；簇基因B涉及PQQ跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，即通過(guò)修飾某種已經(jīng)存在的轉(zhuǎn)運(yùn)體系實(shí)現(xiàn)PQQ的轉(zhuǎn)運(yùn)；簇基因C是催化PQQ生物合成反應(yīng)最后一步的酶；簇基因D功能研究結(jié)果繁多，但在M.extorquens AM 1中簇基因C和D是以融合基因形式存在的，二者是一個(gè)復(fù)合體；簇基因E可能涉及PQQ生物合成中某種酶的輔因子的合成；簇基因F和G可能負(fù)責(zé)小肽的加工。

通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，pqqF與大腸桿菌蛋白酶Ⅲ和人胰島素降解酶都具有一定的同源性，N端區(qū)域與線粒體蛋白酶亞基具有同源性[23]。菌體中其他一些類(lèi)似pqqF的蛋白酶可以在一定程度上代替pqqF，在PQQ合成中發(fā)揮相同作用[24，25]。也有相關(guān)報(bào)道推斷pqqF可能是起到內(nèi)切酶的作用，在PQQ合成的某個(gè)階段，當(dāng)2個(gè)前體完成環(huán)合后將其從pqqA前體上切離下來(lái)[15]，也就是說(shuō)pqqF參與基質(zhì)（由pqqA編碼）中的肽鍵的斷裂，從而釋放PQQ。

已有學(xué)者從研究PQQ的生物合成基因及調(diào)控機(jī)理入手，運(yùn)用基因工程方法，對(duì)PQQ基因的克隆、表達(dá)以及定向化可以改變?cè)季甑倪z傳性狀，進(jìn)而構(gòu)建出“超級(jí)菌株”，這可能是提高產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)PQQ發(fā)酵水平的一個(gè)重要途徑。雖然目前對(duì)PQQ生物合成途徑已經(jīng)有了一定的認(rèn)識(shí)，但對(duì)PQQ生物合成途徑及某些PQQ合成基因的功能尚不清楚，如pqqE、pqqF以pqqG的確切功能需要加以研究，PQQ合成的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，PQQ合成基因之間的協(xié)調(diào)作用、PQQ合成與醌酶表達(dá)的關(guān)系、外部因素影響PQQ生物合成的機(jī)制等問(wèn)題需要深入探討。此外，是否還存在其他PQQ基因，基因的確切功能將是下一步研究的重點(diǎn)和突破口之一。當(dāng)PQQ生物合成基因搞清楚之時(shí)，構(gòu)建高產(chǎn)PQQ工程菌就有了可能，PQQ產(chǎn)量就會(huì)大大提高，此物質(zhì)在實(shí)踐中的應(yīng)用研究也會(huì)得到廣泛地開(kāi)展。

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