雜合二倍體馬鈴薯RH再生體系的初步研究

摘要：以雜合二倍體馬鈴薯（Solanum tuberosum）RH89-039-16 （RH）無菌植株為材料，利用控制變量法對植物生長素和細胞分裂素濃度進行篩選以獲得再生體系所需激素配比。結果表明，葉片愈傷組織誘導的培養基激素濃度配比為ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；莖段愈傷組織誘導的培養基激素濃度配為比 ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L；愈傷組織分化不定芽的培養基激素濃度配比為ZT 2.0 mg/L+GA3 10 mg/L。

關鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；愈傷組織；不定芽；分化；再生體系

中圖分類號：S532 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0493-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.058

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為僅次于小麥、玉米的第三大糧食作物，是中國第四大主糧。目前，對馬鈴薯品種改良的研究主要集中在常規育種和基因工程育種等方面[3，4]。常規育種方法存在人力、物力、財力上消耗大、周期長等問題，自然界優良的種質難以被及時發現利用，因此某種程度上阻礙了現代農業的發展。對馬鈴薯而言，還存在一些難以逾越的“生物學路障”，如馬鈴薯遺傳分離復雜，后代篩選繁瑣?；蚬こ逃N是以分子育種以及分子育種與傳統育種相結合的方法來進行作物育種的，這種相結合的方法有著更為突出的優勢。隨著馬鈴薯基因組序列的公布，高效遺傳轉化技術體系和馬鈴薯EST數據庫的建立，為發掘馬鈴薯功能基因創造了十分有利的條件。在研究基因功能的過程中，首先要了解該基因在植物生長發育及代謝調控過程中所發揮功能與作用，因此在功能基因組的大規模挖掘和鑒定研究中，最重要和最直接研究手段就是創造各種飽和的突變體庫。本試驗所采用的材料雜合二倍體馬鈴薯RH89-039-16（RH）的全基因組序列已經由國際馬鈴薯基因組測序委員會（PGSC）測序完成，并已于2011年7月在《自然》雜志上公布了測序成果[1，2]。

目前，最直接且最主要的突變體庫創建方法為插入突變體庫的構建，是利用農桿菌介導技術將一段外源的DNA元件插入到基因序列中，導致其結構破壞而引起突變，產生帶有該DNA序列標簽的突變體，利用PCR和測序技術獲取插入突變位點序列信息[5，6]。但在利用農桿菌介導技術插入外源基因時，必須構建該材料的再生體系。本試驗初步篩選了適宜馬鈴薯RH的再生體系為后續將目標片段轉入馬鈴薯基因組，研究其基因功能打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試材料 采用生長15～20 d的馬鈴薯材料為雜合二倍體馬鈴薯RH89-039-16（RH）無菌試管苗。在MS基礎培養基中進行擴繁，培養溫度為（25±2）℃，光照14 h/d，采用日光燈補光。

1.1.2 試劑 所用植物生長調節劑IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT、GA3以及試驗用試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產品。

1.2 方法

以前人的研究作為參考[7-15]，利用控制變量法對植物生長調節劑濃度進行篩選。結合預試驗結果，選用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生長素ZT之間的配比來誘導愈傷組織；選用ZT、6-BA和GA3之間的配比來誘導愈傷組織不定芽分化。

1.2.1 RH莖段、葉片愈傷組織的誘導 選取在普通MS培養基中培養20 d左右的馬鈴薯RH無菌苗作為材料，將莖段切去生長點，每段約1 cm。將長勢良好的葉片分為3段，分別放入含有植物生長調節劑的MS培養基中培養20 d，篩選愈傷組織誘導培養基。

1.2.2 RH愈傷組織不定芽的分化 將得到的鮮綠色較為緊實的愈傷組織轉入誘導分化不定芽的篩選培養基中，選用不同的ZT和6-BA以及ZT和GA3的配比，將愈傷組織培養20 d左右，觀察記錄不定芽發生率。

2 結果與分析

2.1 RH莖段、葉片愈傷組織誘導培養基的選擇

在對馬鈴薯RH愈傷組織誘導培養基進行篩選時，利用6-BA和KT和植物生長素進行激素配比時，無法得到愈傷組織。本試驗采用ZT和IAA、ZT和NAA、ZT和2，4-D的不同配比，分別對馬鈴薯莖段和葉片進行愈傷發生研究。從表1～表3可知，分別利用細胞分裂素6-BA、KT和植物生長素的各種配比不利于雜合二倍體馬鈴薯RH愈傷組織的發生，而在利用更高效的ZT作為細胞分裂素時有很好的誘導作用。當ZT濃度過低時，并不利于愈傷組織的形成，只有ZT和植物生長素配比較為接近時，才會產生較好的愈傷組織，尤其是ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L、ZT 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L、ZT 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L時RH葉片愈傷發生率較高，且得到的愈傷形態較為致密；當ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L、ZT 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L時RH莖段愈傷發生率較高，且得到的愈傷形態較為致密。圖1為得到較好愈傷組織培養基以及愈傷組織形態。

2.2 RH愈傷組織不定芽分化誘導培養基的選擇

將得到的較好的愈傷組織進行不定芽分化誘導，利用ZT和6-BA、ZT和GA3的配比，對愈傷組織分化不定芽的激素進行篩選，結果見表4、表5。經過20 d左右的培養，ZT 2 mg/L+GA3 10 mg/L分化培養基中分化出不定芽，尤其在由葉片 （ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）、莖段（ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L）誘導的愈傷組織分化不定芽效率最高。分化不定芽形態見圖2。

3 小結與討論

由于馬鈴薯對植物激素耐受性的特點，在對不同品種馬鈴薯進行再生體系的研究顯得十分必要。在試驗過程中，證明品種間的差異導致內源激素的耐受性不一。本試驗初步篩選出適宜馬鈴薯RH的再生體系，為后續開展的轉基因品種改良和基因功能的研究打下了一定基礎。

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