抗疏健骨顆粒水提工藝研究

抗疏健骨顆粒水提工藝研究

杜星，郭東艷，史傳道，王露，曹瑞

(陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046)

摘要：目的優化抗疏健骨顆粒水提工藝條件，為抗疏健骨顆粒劑的進一步研究奠定基礎。方法以β-蛻皮甾酮含量及出膏率為評價指標，在單因素實驗的基礎上，通過正交試驗篩選抗疏健骨顆粒最佳水提工藝。結果影響水提工藝各因素的作用主次為:C提取次數>B提取時間>A溶劑用量，最佳提取工藝條件是A2B2C3，即用10倍量水，提取3次,每次90 min。結論通過單因素試驗、正交試驗設計優選得到的抗疏健骨顆粒中牛膝、白術2味藥材的水提工藝條件穩定可行。

關鍵詞：抗疏健骨顆粒；β-蛻皮甾酮；正交設計；提取工藝

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.022

中圖分類號：R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)01-0074-03

基金項目:陜西省科技廳資助項目(2012KTCL03-22)。

作者簡介:杜星(1988-)，女，碩士研究生，主要從事中藥新制劑與新劑型研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-08-06)

Study on the process of water extraction for Kangshu Jiangu Granules

DU Xing,GUO Dongyan,SHI Chuandao,WANG Lu,CAO Rui

(Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,Shanxi Provincce,China)

Abstract：ObjectiveTo optimize water extraction method for Kangshu Jiangu Granules and lay a solid foundation for its further study.MethodsThe extracting method of Kangshu Jiangu Granule was optimized by orthogonal design,taking the extraction rate of β-ecdysterone and extract yield as indexes.ResultsThe factors that influence water extraction:C extraction times>B extraction time>A solvent consumption.The optimum extracting condition was A2B2C3:with the volume of 10 folds,extracting for 3 times,90mins one time.ConclusionThe optimum technology is stable and feasible for the extraction of Kangshu Jiangu Granules by orthogonal and single factor experiment.

Keywords:Kangshu Jiangu Granules;β-ecdysterone;orthogonal design;extraction process

抗疏健骨顆粒由淫羊藿、杜仲、牛膝、白術、丹參等藥物組成，具有補腎健脾、活血壯骨之功，主要用于脾腎兩虛、氣血瘀阻導致的骨質疏松癥。牛膝是我國常用中藥材之一，具有補肝腎、強筋骨、通淋利尿、引血下行之功[1]。目前發現牛膝中的活性成分主要為皂苷、植物甾酮、多糖以及黃酮類和生物堿類物質[2]。現代藥理學研究表明，牛膝具有免疫調節、抗炎、抗菌、子宮興奮、抗骨質疏松等多種作用[3-6]。白術主要含揮發油、白術內酯、白術多糖、苷類、氨基酸等成分，揮發油中的白術內酯類成分是白術中比較有特征的成分，也是重要的活性成分[7]，另外蒼術酮不穩定，在空氣中易氧化[8]。白術具有健脾益氣、調節胃腸功能、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、延緩腎臟衰老等作用[9-11]。結合2味藥材所含化學成分的理化性質及現代藥理研究結果，本實驗擬在單因素實驗的基礎上，以β-蛻皮甾酮含量及出膏率為評價指標，采用4因素3水平的L9(34)正交實驗設計對水提工藝進行優化，為抗疏健骨顆粒的進一步研究提供參考依據。

1實驗材料

1.1材料牛膝(批號：130401)、白術(批號：121201)均購于西安盛興中藥飲片有限責任公司，β-蛻皮甾酮對照品(供含量測定用，批號:111638-200603，中國藥品生物制品檢定所)，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Honeywell)，水為過濾后的娃哈哈純凈水。

1.2儀器安捷倫1260型高效液相色譜儀(G1329B型進樣器,G1311C型四元泵，G4212B型二極管陣列檢測器，ChemStation for LC 3D systems)。METTLER TOLEDO(AL204)電子天平(萬分之一)，Sartorius MC電子天平(十萬分之一)。D101型電熱鼓風干燥箱。

2方法與結果

2.1浸泡時間及吸水率的考察按處方比例稱取牛膝、白術，共54 g,加5倍量水進行浸泡，至藥物完全浸透，濾去多余水分，藥渣稱重，記錄藥材吸水后的重量，計算吸水率。

表1　藥材吸水率試驗結果( n=3)

結果表明，藥材的吸水率為71.4%，即在首次加水時應多加1.0倍量。

2.2β-蛻皮甾酮含量測定

2.2.1色譜條件Thermo ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈-水-甲酸(16∶84∶0.1)，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫為室溫。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取β-蛻皮甾酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液制備精密移取各樣品液10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4標準曲線的繪制分別精密吸取β-蛻皮甾酮對照品溶液(濃度0.1 mg/mL)1,2,4，6，8，10，12 μL，按上述色譜條件注入色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，β-蛻皮甾酮含量(μg)為橫坐標繪制標準曲線。計算的回歸方程為：Y=1 668.2X+104.16，相關系數R2=0.999 9,β-蛻皮甾酮在0.1～1.2 μg之間線性關系良好。

2.2.5樣品測定精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，依據2.2.1項下色譜條件進行測定。

2.3出膏率的測定精密吸取各濃縮定容至100 mL的樣品液10 mL,置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱內干燥至恒重，至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。按下式計算出膏率。出膏率=[(浸膏重量×10)/藥材重量]×100%

2.4單因素試驗

2.4.1提取時間考察按處方比例稱取牛膝、白術5份，每份54 g，分別加10倍量水煎煮1次，每次30，60，90，120，150 min，濾過，濃縮，定容至100 mL量瓶中。結果見表2。

表2　不同提取時間考察結果

2.4.2加水量考察按處方比例稱取牛膝、白術6份，每份54 g，分別加6，8，10，12，14，16倍量水，煎煮2次,每次90 min，濾過，合并濾液，濃縮，定容至100 mL量瓶中。結果見表3。

表3　不同加水量考察結果

2.4.3提取次數考察按處方比例稱取牛膝、白術4份，每份54 g，加10倍量水分別提取1,2，3，4次，每次90 min，濾過，濃縮，分別定容至100 mL量瓶中。結果見表4。β-蛻皮甾酮含量在第1次時為57.94 μg/mL，第2次為16.58 μg/mL，第3次為6.31 μg/mL。由此可以看出，提取3次時已基本提取完全。

2.5正交試驗優選最佳水提工藝

2.5.1試驗設計及結果[12-15]參照單因素設計試驗

表4　不同提取次數考察結果

結果，選擇加水量，提取時間，提取次數3個因素，每個因素選擇3個水平，按L9(34)正交表進行試驗，以出膏率、β-蛻皮甾酮含量的加和為綜合指標篩選最佳提取工藝參數。因素水平表見表5。

表5　因素水平

2.5.1.1試驗方法按處方比例稱取牛膝、白術9份，每份54 g,按照正交試驗因素水平表安排用L9(34)正交表進行提取，濾過，濾液濃縮并定容至100 mL量瓶中，備用。

2.5.1.2出膏率測定精密移取10 mL樣品液至已干燥恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥12 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱重。按下式計算出膏率，結果見表6。出膏率=[浸膏重量×10/藥材重量]×100%。

2.5.1.3β-蛻皮甾酮含量測定按單因素項下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算β-蛻皮甾酮含量，結果見表6,方差分析結果見表7。綜合評分(OD)=0.4W1/Wmax1+0.6W2/Wmax2

表6　正交試驗設計與結果

表7　正交試驗方差分析

以綜合評分為考察指標，由表6中極差R值大小顯示，各因素的作用主次為C(提取次數)>B(提取時間)>A(溶劑用量)。表7方差分析結果表明：C因素各水平之間差異具有顯著性(P<0.05),A、B因素各水平之間差異無顯著性(P>0.05)。綜上所述最終提取工藝確定為：A2B2C3，即10倍量水提取3次，每次90 min。

2.5.2驗證試驗為了考察正交試驗的結果是否具有重現性,進行驗證實驗。稱取以上2味藥材3份，每份108 g，按照優選的工藝條件進行提取，測定出膏率、β-蛻皮甾酮含量，結果見表8。

表8　驗證實驗結果

驗證試驗結果表明：該工藝條件合理可行，具重現性。

3討論

牛膝是一味補骨中藥，現代藥理研究結果表明，含牛膝的補骨中藥組方可減輕大鼠子宮重量，增加骨小梁密度、面積、總體積及密質骨面積，減小骨髓腔面積[16]，從牛膝中提取的甾酮成分具有明顯的促進促成骨細胞增長的活性[17]，考慮到甾酮類成分為牛膝中的主要活性成分，因此在工藝篩選中以β-蛻皮甾酮含量作為評價指標之一。筆者曾對白術中所含揮發油的含量進行了預實驗研究，結果表明，白術中的揮發油含量過于偏低，采用水蒸汽蒸餾法提取白術揮發油，出油率僅為0.2%。有文獻報道白術水煎液可明顯促進骨髓細胞增殖，增強機體免疫力[18]，綜合考慮到大生產及節約成本，本方中的白術考慮舍棄提取揮發油，直接水煎煮提取白術中的活性成分，并以出膏率作為評價指標之一。

本試驗建立了β-蛻皮甾酮含量及出膏率的測定方法。通過正交設計試驗法優選所得的最佳提取工藝為10倍量水提取3次，每次90min，驗證試驗結果表明，該工藝條件合理可行，重現性較好。

參考文獻：

[1]陳坤.牛膝對肝臟損傷保護作用的研究[D].揚州:揚州大學,2010.

[2]孟大利.中藥牛膝化學成分及其生物活性的研究[D].沈陽:沈陽藥科大學,2004.

[3]李宗鍇,李電東.牛膝多糖的免疫調節作用[J].藥學學報,1997,32(12):2-8.

[4]高昌琨,高建,馬如龍,等.牛膝總皂苷抗炎、鎮痛和活血作用研究[J].安徽醫藥,2003,7(4):248-249.

[5]劉建華,梁生旺,王淑美.牛膝皂苷栓的抗生育作用研究[J].河南中醫學院學報,2006,21(1):35,37.

[6]李建新,門田重利.牛膝的抗骨吸收活性成分[J].亞太傳統醫藥,2006(1):77-78.

[7]楊娥,鐘艷梅,馮毅凡.白術化學成分和藥理作用的研究進展[J].廣東藥學院學報,2012,28(2):218-221.

[8]陳曉萍,張長林.白術不同化學成分的藥理作用研究概況[J].中醫藥信息,2011,28(2):124-126.

[9]張奕強,許實波,林永成.白術內酯系列物的胃腸抑制作用[J].中藥材,1999,22(12):636-640.

[10]朱金照,張捷,許其增,等.白術促進大鼠胃腸道運動的機制探討[J].中國臨床藥學雜志,2001,10(6):365-368.

[11]金維哲,王大江,王溯,等.中藥白術延緩小鼠腎臟衰老的形態學研究[J].中國老年學雜志,1997,17(6):365-367.

[12]趙曉平,呂楊,范小璇,等.健腦益智膠囊提取工藝研究[J].陜西中醫學院學報,2013,36(5):83-85.

[13]郭東艷,張麗娟,師延瓊,等.基于譜效相關的多指標綜合加權評分法優選生地黃的提取工藝[J].中成藥,2011,33(12):2183-2185.

[14]黃曉巍,初洪波,位鴻,等.正交試驗法優選參紅補血顆粒提取工藝[J].吉林中醫藥,2012,32(11):1152-1153.

[15]薛立平,張艷,尤獻民,等.中藥定心膠囊的提取工藝研究[J].長春中醫藥大學學報,2011,27(3):490-491.

[16]崔洪英,張柏麗,安秀玲.補腎中藥對骨質疏松大鼠骨形態的影響[J].天津中醫,1997,14(5):35-36.

[17]高曉燕,王大為,李發美,等.牛膝提取物對成骨樣細胞增殖的作用[J].沈陽藥科大學學報,2000,17(3):210-213.

[18]牛新華,邱世翠,丁長玲.白術對小鼠骨髓細胞增殖和白細胞介素-1的影響[J].中國現代醫學雜志,2002,12(3):83-84.