對凝血酶誘導(dǎo)血小板活化分子機(jī)制的研究

孫海燕 毛德奎 董俏言 于愛平★

（1.威海衛(wèi)人民醫(yī)院 山東 威海 264200；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850）

血小板是血液中的重要成分，其在保持血管的完整性及防止血管損傷后出血等方面均發(fā)揮重要的作用。血小板是人體防御出血的重要機(jī)制，此防御機(jī)制與血小板的活化聚集密切相關(guān)。但是，血小板過度的活化聚集又會導(dǎo)致血栓形成，甚至?xí)l(fā)急性心肌梗死、腦卒中和 不穩(wěn)定型心絞痛等血栓栓塞性疾病[1-3]。PI3K/Akt信號通路是血小板活化過程中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]。PI3K通路的活化可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）等蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，促進(jìn)G1期的進(jìn)展，從而加速細(xì)胞代謝的周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。PTEN蛋白是PI3K/AKT信號通路的負(fù)調(diào)控因子，PTEN蛋白可抑制PI3K/AKT信號通路的激活。PTEN/ PI3K/Akt的信號通路已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，然而該通路在凝血酶誘導(dǎo)血小板活化的過程中是否具有相應(yīng)的作用還有待于進(jìn)行深入的研究。為了進(jìn)一步探討凝血酶誘導(dǎo)血小板活化分子的機(jī)制，為研發(fā)阻斷血小板活化的抗血小板聚集類藥物提供理論依據(jù)，筆者對36例健康人的血液標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行回顧性研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究的對象為36例健康人的血液標(biāo)本。這36例健康人均符合以下情況：①其在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的2周內(nèi)均未服用過藥物。②其均無吸煙史。在這36例健康人中，有男性20例，女性16例。他們的年齡在20歲～29歲之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 本次研究所使用的抗體均購自Cell Signaling Technology公司，Thrombin（凝血酶）、Apyrase（ATP酶抑制劑）均購自 sigma公司，PGE1（前列腺素E1）購自Cayman Chemical公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自Thermo公司。

1.2.2 制備血小板的方法 按照靜脈采血指南中的操作方法，用濃度為3.8%（w/v） 的枸櫞酸鈉抗凝管采集研究對象肘部的靜脈血液作為標(biāo)本。將血液標(biāo)本輕微混勻，以1000 rpm的轉(zhuǎn)速對血液標(biāo)本進(jìn)行15 min的離心處理后，吸取上層血漿，即得到PRP（富血小板血漿）。向PRP中加入終濃度為5 mM的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.1μg/mL的PGE1、1 U/mL 的Apyrase溶液，靜置20min。然后，以2000rpm的轉(zhuǎn)速對此溶液進(jìn)行10min的離心處理后即獲得血小板沉淀液，棄上清液。將制取的血小板重懸于HEPES-Tyrode（臺氏液）緩沖液中，將血小板的終濃度調(diào)整為106/μL。

1.2.3 對凝血酶進(jìn)行處理的方法 將0.5U/mL的Thrombin與血小板 在 37℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中用不同的時(shí)間共同孵育，或配置不同濃度的Thrombin與血小板在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中共同孵育8h。將共同孵育后的實(shí)驗(yàn)樣本加入細(xì)胞裂解液，進(jìn)行冰浴30 min后，以12000 rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下進(jìn)行15 min的離心處理，取上清液測量其蛋白質(zhì)的濃度后備用。另取不做任何處理的血小板作為空白對照標(biāo)本。

1.2.4 進(jìn)行 Western blot 實(shí)驗(yàn)的方法 將蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。使用目的蛋白（Akt、p-Akt、PTEN、p21、p27和skp2）一抗分別與PVDF膜共同孵育。在孵育結(jié)束后，用HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗處理雜交一抗的PVDF膜，最后在暗室 對PVDF膜進(jìn)行顯影。將GAPDH作為內(nèi)參蛋白，樣品中目的蛋白的相對含量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 我們使用SPSS16.0軟件包對本次實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝血酶激活血小板P I3K/Akt信號通路的結(jié)果Akt蛋白是PI3K的下游效應(yīng)蛋白，Akt磷酸化是PI3K通路被激活的標(biāo)志。本次研究主要通過檢測Akt磷酸化的水平來判斷PI3K/Akt的信號通路是否被激活。結(jié) 果顯示，凝血酶能夠激活血小板的PI3K/Akt的信號通路（如圖2-1所示）。在加入凝血酶后能夠顯著上調(diào)血小板中p-Akt蛋白的表達(dá)水平。隨著凝血酶作用時(shí)間的延長，血小板中p-Akt蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且具有時(shí)間依賴效應(yīng)。 在進(jìn)行凝血酶處理的20min后，血小板中p-Akt蛋白的表達(dá)水平最高。隨著凝血酶處理時(shí)間的進(jìn)一步延長，血小板中Akt磷酸化的水平并沒有顯著升高。另外，在使用不同濃度的凝血酶對血小板進(jìn)行處理的8h后，血小板中p-Akt蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，此效應(yīng)在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴效應(yīng)（如圖2-2所示）。在凝血酶的濃度達(dá)到4U/mL時(shí)，血小板中p-Akt蛋白的表達(dá)水平最高。

圖2-1 凝血酶與血小板中的AKT磷酸化水平的時(shí)效關(guān)系

圖2-2 凝血酶與血小板中的AKT磷酸化水平的量效關(guān)系

2.2 凝血酶抑制PTEN蛋白表達(dá)的結(jié)果 PTEN蛋白是PI3K/AKT信號通路的負(fù)調(diào)控因子。為了明確凝血酶對PI3K/Akt信號通路的活化機(jī)制，我們進(jìn)一步測定了PTEN蛋白的表達(dá)情況（如圖2-3和圖2-4所示）。與空白對照血小板標(biāo)本相比，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本在加入凝血酶后，血小板中PTEN蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且具有時(shí)間和濃度的依賴效應(yīng)。

圖2-3 凝血酶與血小板中PTEN表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

圖2-4 凝血酶與血小板中PTEN表達(dá)的量效關(guān)系

2.3 凝血酶抑制周期蛋白p21蛋白和p27蛋白表達(dá)的結(jié)果 通過檢測凝血酶對PI3K/Akt信號通路的下游分子--細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21和p27蛋白的表達(dá)水平，可以判斷出凝血酶對PI3K/Akt信號通路的影響。本次研究結(jié)果顯示，凝血酶可顯著下調(diào)血小板中p21和p27蛋白的表達(dá)水平，且其抑制效果會隨著時(shí)間和凝血酶濃度的增加而加強(qiáng)（如圖2-5至2-8所示）。

圖2-5 凝血酶與血小板中p21表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

圖2-6 凝血酶與血小板中p21表達(dá)的量效關(guān)系

圖2-7 凝血酶與血小板中p27表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

圖2-8 凝血酶與血小板中p27表達(dá)的量效關(guān)系

3 討論

血小板是由成熟的巨 核細(xì)胞裂解產(chǎn)生的人體含量最多的無核細(xì)胞[5]。血小板在止血、消炎和傷口愈合的過程中均發(fā)揮著重要的作用。凝血酶作為血小板活化的主要配體之一，在血栓的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。但是，凝血酶在激活血小板表面相應(yīng)的蛋白酶活化受體后，血小板內(nèi)還有哪些細(xì)胞內(nèi)分子或信號通路參與該活化作用尚未得到完全的證實(shí)。PI3K可以被多種炎癥趨化因子、細(xì)菌毒素及血管活性激動劑激活，在炎癥、癌癥及心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要的作用[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K通路是調(diào)節(jié)血壓及血栓形成的重要轉(zhuǎn)錄途徑，PI3K通路主要是通過激活其下游效應(yīng)蛋白Akt的磷酸化而發(fā)揮作用。經(jīng)凝血酶活化前后，血小板內(nèi)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平會發(fā)生變化，活化后的血小板內(nèi)的Akt在絲氨酸473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，使PI3K/Akt的信號通路被激活。細(xì)胞周期蛋白p21 和p27主要通過對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制作用來阻斷G1期到S期的轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控。細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）是SCF 泛素連接酶復(fù)合體的特異底物識別亞單位F-box蛋白家族的成員之一，此蛋白可特異性地作用于細(xì)胞周期蛋白[9]，使其通過泛素-蛋白質(zhì)酶體的途徑降解，從而調(diào)控G1期向S期的轉(zhuǎn)換。

綜上所述，凝血酶可通過激活血小板內(nèi)的PTEN/PI3K/Akt的信號通路而發(fā)揮作用，并可通過調(diào)控血小板內(nèi)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)血小板的活化。

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