miR-205在ITP患者外周血單個核細胞中的表達及意義*

鄧順江，黃韋華，吳林洪，張 蕾，葉 辛，劉 鵬，李騰達，龍曙萍，錢 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院，上海 200003；4.解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)被認為是一種由自身抗體介導的血小板破壞增加以及生成減少引起的疾病，臨床上以血小板計數減少和皮膚黏膜出血為特點[1]。但研究發(fā)現其發(fā)病機制非常復雜，目前認為ITP的發(fā)病是一個多步驟的過程，各種免疫細胞包括T,B細胞、抗原遞呈細胞以及相關的細胞因子在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2～6]。

Micro-RNA(miRNA)是一種長度大約為22個核苷酸的微小非編碼RNA，它在轉錄后水平調控基因的表達[7]，因而參與體內多種生理病理過程。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，最近有研究發(fā)現，miRNA在ITP的發(fā)病中也發(fā)揮了重要的作用[8～10]。例如，miR-155在ITP患者的外周血單個核細胞(PBMC)中表達上調，而在治療后表達下調[11]；miR-302c-3p，miR-483-5p等miRNA在ITP兒童患者的血漿中表達水平升高。然而，ITP患者中具體有哪些miRNA表達異常目前還有待進一步研究，miRNA在ITP的發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制至今還未闡明。

我們前期通過基因芯片的實驗發(fā)現miR-205在ITP患者中表達明顯上調，此次研究通過實時定量PCR的方法檢測患者PBMC中miR-205的表達水平，并分析其與患者血小板計數之間的相關性，為后續(xù)研究提供新線索。

1 材料和方法

1.1 標本來源 選取長海醫(yī)院2014～2015年收治的ITP患者外周抗凝全血43例，其中男性21例，女性22例，年齡為22～63歲，診斷標準符合“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)”[12]，且均未接受過相關治療。同時選取體檢中心健康對照組38例，其中男性20例，女性18例，年齡為20～62歲，每例標本大約2 ml。ITP組和健康對照組在年齡和性別上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 反轉錄試劑盒，PCR試劑盒(購自takara公司)；Trizo試劑(Invitrogen life technologies)；淋巴細胞分離液，氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)；無水乙醇，異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；DEPC水，dd水，紅細胞裂解液，2 ml EP管，200 μl EP管，Centrifuge 5417 R低溫高速離心機，純水儀，紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)，梯度PCR儀(ABI)，PCR儀(ABI7500)。

1.3 檢測方法 外周血PBMC的分離和總RNA的提取：用淋巴細胞分離液從EDTA-K2抗凝的2 ml靜脈中分離PBMC，用Trizol提取細胞的總RNA，用紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)檢測所提取RNA的濃度及純度。

CDNA的合成以及Real-timePCR反應miR-205以及U6的特異引物由上海賽百勝公司設計和合成，用反轉錄試劑盒進行反轉錄，用定量PCR試劑盒進行核酸擴增，試劑盒購自Takara公司，反轉錄和PCR條件嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 ITP患者分組標準 選取的未經治療的ITP患者歸為初診組(naive ITP group)，ITP患者的治療符合國內標準[12]，經過標準治療后：血小板>100×109/L且病情穩(wěn)定的患者歸完全緩解組(Complete remission group，CR group)，共14例；血小板<100×109/L的患者或治療有效但復發(fā)的患者歸不完全緩解組(incmplete remission group，IR group)，共29例。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism6進行統(tǒng)計分析，組間均值比較采用獨立樣本t檢驗(Studentttests)，相關性分析采用Pearson相關。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ITP患者外周血單個核細胞(PBMC)miR-205的表達 與38例正常對照組相比，43例ITP初診患者(Naive ITP)PBMC miR-205的表達水平更高(1.81±0.48 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.31，P<0.01)；治療后不完全緩解組(IR group)和初診患者相比，miR-205的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.112)，與正常對照組相比，則表達升高(1.63±0.65 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.2，P<0.01)；14例治療后完全緩解組(CR group)治療后(After treatment)PBMC miR-205的表達低于治療前(Before treatment)的表達水平(1.07±0.43 vs 1.91±0.34)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.68，P<0.01)。

2.2 相關性分析 ITP患者PBMC miR-205與血小板計數的相關性分析結果顯示，ITP患者PBMC miR-205與血小板計數呈負相關(r=-0.069 6，P<0.05)，見圖1。

3 討論

MicroRNA是一種微小(19～23個核苷酸)的單鏈非編碼RNA，通過結合mRNA的3’非翻譯序列區(qū)(3’untranslated sequence region，3’-UTR)而使mRNA降解或者抑制相關蛋白質的翻譯，從而在轉錄后水平對基因的表達進行調控，一個microRNA可能結合多個mRNA，一個mRNA也可能被多個microRNA所調節(jié)[13]。研究發(fā)現microRNA在多種疾病狀態(tài)下存在異常的表達，提示其參與了人體的發(fā)病過程。miR-205的編碼基因LOC642587定位于染色體1q32.2區(qū)，miR-205的前體位于LOC642587的第二個內含子和第三個外顯子鏈接的區(qū)域，是一個高度保守的microRNA，在多種疾病中都表現出異常的表達，比如Duan等[14]研究發(fā)現，miR-205通過調節(jié)其靶基因SMAD2而抑制了神經膠質瘤細胞的侵襲能力，在神經膠質瘤組織中，miR-205的表達低于癌旁組織。有研究[15，16]發(fā)現miR-205抑制其靶基因MLL-AF4的mRNA和蛋白質的表達，而MLL-AF4是一種可以引起急性白血病的致癌基因，miR-205高表達的最終結果是抑制細胞的增殖，這給急性白血病的治療找到了新的突破口。Hu等[17]的研究發(fā)現，高表達的miR-205通過抑制其靶基因VEGFA和FGF2從而增加了乳腺癌細胞對化療藥物的敏感度。

圖1 原發(fā)性血小板減少癥(ITP)患者PBMC miR-205表達水平與血小板計數結果的相關性

ITP是臨床上常見的由血小板減少和破壞增多而引起的自身免疫性血液系統(tǒng)疾病。血小板的數量在一定程度上反映了TIP的嚴重程度，患者血小板計數結果越低，表明患者病情越重，反之則病情相對較輕。本次研究通過實時熒光定量PCR的方法，發(fā)現ITP患者PBMC中miR-205表達顯著高于健康對照組，并且miR-205的表達水平與患者外周血血小板計數呈負相關，這提示miR-205可能參與了ITP的發(fā)病，并且可能與ITP 的嚴重程度密切相關，癥狀越嚴重的患者，其miR-205的表達水平也越高。另外我們對43例ITP初診患者進行了跟蹤調查，發(fā)現29例未完全緩解組miR-205的表達水平和初診時相比基本未改變，而14例完全緩解組治療后miR-205的表達水平與治療前相比，顯著降低，這也提示了miR-205與ITP的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關。但miR-205是如何影響血小板的數量的，是作用于哪個靶基因以及通過什么信號通路而參與到ITP的發(fā)病與預后還有待進一步探索。

[1] Wang T，Wang Z，Yang R．Thrombopoietic growth factors in the treatment of immune thrombocytopenic purpura[J]．Crit Rev Oncol Hematol，2011，77(3)：172-183．

[2] Hu Y，Li H，Zhang L，et al．Elevated profiles of Th22 cells and correlations with Th17 cells in patients with immune thrombocytopenia[J]．Hum Immunol，2012，73(6)：629-635．

[3] Cao J，Chen C，Li L，et al．Effects of high-dose dexamethasone on regulating interleukin-22 production and correcting Th1 and Th22 polarization in immune thrombocytopenia[J]．J Clin Immunol，2012，32(3)：523-529．

[4] Wang T，Zhao H，Ren H，et al．Type 1 and type 2 T-cell profiles in idiopathic thrombocytopenic purpura[J]．Haematologica，2005，90(7)：914-923．

[5] Li X，Zhong H，Bao W，et al．Defective regulatory B-cell compartment in patients with immune thrombocytopenia[J]．Blood，2012，120(16)：3318-3325．

[6] 葉 辛，石 磊，谷明莉，等．原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者顆粒溶素、顆粒酶B、穿孔素的表達及臨床意義[J]．現代檢驗醫(yī)學雜志，2014，29(1)：20-23．

Ye X,Shi L,Gu ML,et al.Expression of granzyme B,granulysin and perforin from patients with primary immune thrombocytopenia[J]．J Mod Lab Med，2014，29(1)：20-23．

[7] Bartel DP．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]．Cell，2004，116(2)：281-297．

[8] Sui T，Ma L，Li X，et al．Plasma microRNA profile in immune thrombocytopenia：screening and verification[J]．National Medical Journal of China，2014，94(14)：1083-1086．

[9] Bay A，Coskun E，Oztuzcu S，et al．Plasma microRNA profiling of pediatric patients with immune thrombocytopenic purpura[J]．Blood Coagul Fibrinolysis，2014，25(4)：379-383．

[10] Jernás M，Nookaew I，Wadenvik H，et al．MicroRNA regulate immunological pathways in T-cells in immune thrombocytopenia (ITP)[J]．Blood，2013，121(11)：2095-2098．

[11] Qian BH，Ye X，Zhang L，et al．Increased miR-155 expression in peripheral blood mononuclear cells of primary immune thrombocytopenia patients was correlated with serum cytokine profiles[J]．Acta Haematol，2015，133(3)：257-263．

[12] 中華醫(yī)學會血液分會血栓與止血學組．成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)[J]．中華血液學雜志，2011，32(3)：214-216．

Hemostasis and Thrombosis Group,Hematology Society,Chinese Medical Association.Consensus of Chinese experts on diagnosis and treatment of adult primary immune thromboaytopenia[J]．Chinese Journal of Hematology，2011，32(3)：214-216．

[13] Griffiths-Jones S，Saini HK，van Dongen S，et al．miRBase：tools for microRNA genomics[J]．Nucleic Acids Res，2008，36(Database issue)：D154-158．

[14] Duan Y，Chen Q．TGF-beta1 regulating miR-205/miR-195 expression affects the TGF-beta signal pathway by respectively targeting SMAD2/SMAD7[J]．Oncology Reports，2016，36(4)：1837-1844．

[15] Dou L，Li J，Zheng D，et al．MicroRNA-205 downregulates mixed-lineage-AF4 oncogene expression in acute lymphoblastic leukemia[J]．Onco Targets and Therapy，2013，6(1)：1153-1160．

[16] Dou L，Zheng D，Li J，et al．Methylation-mediated repression of microRNA-143 enhances MLL-AF4 oncogene expression[J]．Oncogene，2012，31(4)：507-517．

[17] Hu Y，Qiu Y，Yague E，et al．miRNA-205 targets VEGFA and FGF2 and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer[J]．Cell Death & Disease，2016，7(6)：e2291．