革蘭陽性球菌對利奈唑胺耐藥機制的研究*

許宏濤，陳東科，賴惠英(北京醫(yī)院檢驗科 國家老年醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730)

利奈唑胺(linezolid，LZD)是一種新型惡唑烷酮類抗生素，2000年在美國上市，主要應(yīng)用于萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)、青霉素耐藥鏈球菌等多重耐藥革蘭陽性球菌的治療。因為自然界中缺乏天然耐藥基因庫，理論上不易出現(xiàn)利奈唑胺耐藥；但事實并非如此，2001年美國哈弗大學(xué)醫(yī)學(xué)院報道了第一株利奈唑胺耐藥的MRSA[1]。而后，多個國家出現(xiàn)了利奈唑胺耐藥葡萄球菌的暴發(fā)性流行。我們收集了2012年1月～2014年12月我院臨床標(biāo)本中出現(xiàn)的6株利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌，對分子流行病學(xué)及其主要耐藥分子機制進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月～2014年12月我院臨床標(biāo)本中對利奈唑胺耐藥的革蘭陽性球菌6株，經(jīng)過VITEK2 COMPACT鑒定5株為柯氏葡萄球菌、1株為糞腸球菌。

1.2 試劑 KB法藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基干粉及E-test藥敏條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；Vitek-2 Compact全自動細菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；ABI-2400 PCR儀購自美國ABI公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自凱捷公司；TaqDNA聚合酶、dNTP和DNA分子量Marker購自日本TaKaRa公司。PCR引物合成由北京賽百盛公司完成。

1.3 藥敏試驗 采用E-test法檢測利奈唑胺、青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬古霉素、替考拉寧、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素的MIC；藥敏方法和折點判斷參照CLSI 2012，以ATCC29213作為質(zhì)控菌株。

1.4 利奈唑胺耐藥基因及相關(guān)突變檢測 細菌基因組DNA提取應(yīng)用凱捷公司的基因組提取試劑盒，23Sr DNA V區(qū)域引物及4個拷貝基因片段引物[2]，L3和L4[3]，cfr[4]基因擴增條件及引物序列參照文獻進行，引物序列見表1；PCR擴增產(chǎn)物序列測定由上海生工公司完成。

1.5 柯氏葡萄球菌PFGE分析 5株柯氏葡萄球菌進行了脈沖場凝膠電泳(PFGE)，染色體DNA制備及電泳條件參照Murchan等[11]的文獻進行，條帶分析應(yīng)用軟件BioNumerics software package (version 5.10， Applied Maths Inc.，Austin，TX，USA)完成。

2 結(jié)果

2.1 抗生素敏感試驗 見表2。5株柯氏葡萄球菌利奈唑胺MIC介于16～64 mg/L，青霉素、苯唑西林及頭孢西丁均耐藥，萬古霉素及替考拉寧敏感；糞腸球菌利奈唑胺MIC為8 mg/L，萬古霉素及替考拉寧顯示敏感。

2.2 利奈唑胺耐藥基因及相關(guān)突變檢測結(jié)果 5株柯氏葡萄球菌均表現(xiàn)為cfr基因陽性(圖1)，23Sr RNA及L4無突變，L3存在兩對氨基酸突變，具體見表1；糞腸球菌cfr基因擴增陰性，存在23SrRNA點突變(表2)。

表1 本研究所應(yīng)用引物序列

表2 6株革蘭陽性球菌主要耐藥機制及抗生素敏感性

注：MIC，最低抑菌濃度；LZD，利奈唑胺；PEN，青霉素；OXA，苯甲異噁唑青霉素；FOX，頭孢西丁；VAN，萬古霉素；TEC，替考拉寧；CIP，環(huán)丙沙星；ERY，紅霉素；TET，四環(huán)素；CHL，氯霉素；S：絲氨酸；Y：酪氨酸；D：天冬氨酸；F：苯丙氨酸。

M：分子量Marker；ATCC29213：陰性對照。

2.3 柯氏葡萄球菌PFGE分型結(jié)果 見圖2。5株柯氏葡萄球菌PFGE分型共分為2型，分別定義為A型和B型，菌株432和485為A型，437，438和470為B型。

3討論利奈唑胺2007年在中國上市，主要用于治療多重耐藥革蘭陽性球菌；耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，我國第一株利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌出現(xiàn)在2009年[5]。利奈唑胺通過與50S核糖體亞基23Sr RNA的V功能區(qū)結(jié)合，阻止50S與30S亞基組合成70S核糖體，抑制細菌蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮抗菌作用。現(xiàn)在已知的利奈唑胺耐藥機制包括：23SrRNA V結(jié)構(gòu)區(qū)的點突變，以G2576T為主，還包括U2500A，G2505A，G2512T，T2504C，C2610G，T2505A及G2766T等，這些突變影響利奈唑胺與靶位的結(jié)合從而減弱利奈唑胺抗菌活性[6]；此外，有學(xué)者報道[7]核糖體蛋白L3或L4突變與利奈唑胺抗菌活性下降相關(guān)，菌株通過核苷酸片段的缺失、序列改變、替換以及插入修飾編碼核糖體蛋白L4，L3的rpl/D，rpl/C基因序列，從而影響肽酰轉(zhuǎn)移酶的空間構(gòu)象，降低抑制利奈唑胺的抗菌活性，從而達到耐藥，這種突變多發(fā)生于細菌染色體上，故不易造成細菌間耐藥性的橫向傳播；第三種已知耐藥機制是菌株通過獲得cfr耐藥基因而達到耐藥[8]，首次報道于臨床分離的MRSA菌株中。cfr基因可甲基化轉(zhuǎn)錄后的rRNA(A2503)，從而使其構(gòu)象改變以影響利奈唑胺與抗菌靶位的結(jié)合而引起耐藥，大量文獻顯示：cfr耐藥基因可通過質(zhì)粒在不同種屬細菌間進行水平傳播，而引起醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行[9]。此外，cfr耐藥基因還可介導(dǎo)對氯霉素及林可霉素的交叉耐藥，由此可見cfr基因是利奈唑胺耐藥菌株醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行的潛在危險因素。

注：菌株485，432：PFGE A型；菌株470，438，437：PFGE B型。

我們的研究中利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌經(jīng)鑒定全部為柯氏葡萄球菌，其它凝固酶陰性葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)利奈唑胺耐藥，5株菌均來自患者無菌部位并伴隨感染癥狀，鑒定其均為感染菌；5株柯氏葡萄球菌耐藥分子機制均表現(xiàn)為cfr基因陽性伴隨L3的158位及159位突變，未見23SrRNA突變及L4的突變；cfr基因多見于質(zhì)粒，容易引起醫(yī)院內(nèi)播散；L3突變最近報道較多，但在利奈唑胺耐藥中cfr基因及L3突變同時存在時其分別所起的作用及程度還需要在以后研究中明確，這也是我們下一步研究的目標(biāo)。而利奈唑胺耐藥糞腸球菌分離自患者尿標(biāo)本，耐藥由23SrRNA的G2576T點突變引起，以往研究顯示：糞腸球菌中，編碼23S rRNA的基因有4個相同的片段(拷貝)，其突變的數(shù)量與耐藥水平呈量效關(guān)系，糞腸球菌(菌株號501)的23SrRNA第5功能區(qū)的PCR擴增片段測序2576位為單一峰，顯示其為一致性的G到T的點突變，此株糞腸球菌未檢測出cfr基因及L3和L4的突變。

在分子流行病學(xué)研究中我們應(yīng)用PFGE技術(shù)對5株柯氏葡萄球菌進行了親緣性研究，結(jié)果顯示：菌株432和485為同一分子克隆(A型)，它們來自同一病房(ICU)的病人，且485被分離前病人未應(yīng)用過利奈唑胺抗生素，提示菌株有播散的可能；另外三株菌(437，438和470)為PFGE分型的B型，病人在分離出利奈唑胺耐藥菌株前均應(yīng)用過利奈唑胺藥物，分子遺傳背景相同提示其存在院內(nèi)傳播可能。

近年利奈唑胺耐藥的革蘭陽性球菌已在國內(nèi)多家醫(yī)院臨床標(biāo)本中檢測出[10]，其為革蘭陽性球菌的有效抗感染治療帶來了困難；臨床微生物室應(yīng)加強利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌的監(jiān)測，加強合理應(yīng)用抗生素的宣教，以減少多重耐藥菌的出現(xiàn)。

[1] Tsiodras S，Gold HS，Sakoulas G，et al．Linezolid resistance in a clinical isolate ofStaphylococcusaureus[J]．Lancet，2001，358(9277)：207-208．

[2] Mendes RE，Deshpande LM，F(xiàn)arrell DJ，et al．Assessment of linezolid resistance mechanisms amongStaphylococcusepidermidiscausing bacteraemia in Rome，Italy[J]．The Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2010，65(11)：2329-2335．

[3] Toh SM，Xiong L，Arias CA，et al．Acquisition of a natural resistance gene renders a clinical strain of methicillin-resistantStaphylococcusaureusresistant to the synthetic antibiotic linezolid[J]．Molecular Microbiology，2007，64(6)：1506-1514．

[4] Kehrenberg C，Schwarz S．Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistantStaphylococcusisolates[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2006，50(4)：1156-1163．

[5] Zhao C，Sun H，Wang H，et al．Antimicrobial resistance trends among 5 608 clinical Gram-positive isolates in China：results from the Gram-Positive Cocci Resistance Surveillance program (2005～2010)[J]．Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2012，73(2)：174-181．

[6] LaMarre J，Mendes RE，Szal T，et al．The genetic environment of the cfr gene and the presence of other mechanisms account for the very high linezolid resistance ofStaphylococcusepidermidisisolate 426-3147L[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2013，57(3)：1173-1179．

[7] Locke JB，Hilgers M，Shaw KJ．Mutations in ribosomal protein L3 are associated with oxazolidinone resistance instaphylococciof clinical origin[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53(12)：5275-5278．

[8] Liu Y，Wang Y，Schwarz S，et al．Transferable multiresistance plasmids carrying cfr inEnterococcusspp．from swine and farm environment[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2013，57(1)：42-48．

[9] Morales G，Picazo JJ，Baos E，et al．Resistance to linezolid is mediated by the cfr gene in the first report of an outbreak of linezolid-resistantStaphylococcusaureus[J]．Clinical Infectious Diseases，2010，50(6)：821-825．

[10] 蔡加昌，周宏偉，胡燕燕，等．耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌對利奈唑胺耐藥機制及分子流行病學(xué)研究[J]．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012，32(6)：532-536．

Cai JC，Zhou HW，Hu YY，et al．Linezolid resistance mechanisms and molecular epidemiology of clinical isolates of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci[J]．Chin J Microbiol Immunol，2012，32(6)：532-536．