白族、彝族非綜合征性耳聾人群SLC26A4基因突變分析*

林 墾，馬 靜，王美蘭，李正才，婁 凡，毛志勇，張鐵松，阮 標

(1.昆明市兒童醫院耳鼻喉頭頸外科，昆明 650228；2.昆明醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科，昆明 650000)

SLC26A4基因位于人類染色體7q31，其mRNA全長4 930 bp，含21個外顯子，開放閱讀框架2 343 bp，編碼780個氨基酸Pendrin。SLC26A4基因突變可導致常染色體隱性耳聾和Pendred綜合征。非綜合征型耳聾占所有遺傳性耳聾的70%，這其中80%為常染色體隱性遺傳。大前庭導水管綜合征(enlarge vestibular aqueduct syndrome，EVAS)是常染色體隱性遺傳性耳聾的常見類型。EVAS的發生與SLC26A4基因突變關系密切。云南目前少數民族聾病的分子遺傳學的病因研究報道相對較少。本文針對云南地區白族、彝族非綜合征型耳聾患者檢測SLC26A4基因編碼區的核苷酸序列變化，探索聾病的分子病因，為少數民族聾病的遺傳咨詢和預防提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：采集2010年1月～2016年5月昆明市兒童醫院耳鼻喉科門診散發的234例白族、彝族中度、重度以上的非綜合征型耳聾患者外周血，提取DNA。所有患兒經過臨床檢查均確診為非綜合征性中度、重度以上的感音神經性聾。包括132例白族，女性46例，男性86例，年齡10月～18歲；102例彝族，男性63例，女性39例，平均年齡8月～18歲。該研究經本院醫學倫理委員會決議通過，家屬簽署知情同意書。

1.1.2 主要儀器和試劑：ABI 3730XL測序儀，美國ABI9700 PCR儀，Mass ARRAY微量點樣系統以及試劑盒，美國Sequenom公司的Mass ARRAY DNA質譜陣列基因分析系統。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集：通過監護人及本人掌握被檢測者的病史及家族史資料，其內容包括耳聾病史、家族史、聾兒出生史、個人史(耳毒性藥物應用情況、頭部外傷史)等。對所有耳聾患者進行全面的臨床檢查(顳骨CT和頭顱MRI檢查)和聽力學評估(耳聲發射、聽性腦干誘發電位)，并抽取外周靜脈血5ml以進行基因組DNA的制備及基因突變篩查。

1.2.2 飛行時間質譜(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)技術檢測：采集患者5 ml外周靜脈血液樣本行備用檢測，對樣本提取DNA后行定量和純度檢測，引物擴增和延伸，利用蝦堿式磷酸酶對PCR產物進行處理，以去除擴增反應中剩余的dNTP，產物純化，去除鹽離子。實驗過程及數據統計由華大基因公司協助完成。

2 結果

2.1 TOF-MS檢測 云南地區白族、彝族非綜合征型耳聾人群中SLC26A4基因突變頻率最高的位點為IVS7-2A>G，突變峰圖見圖1。

IVs7-2A→G純合突變 IVs7-2A→G雜合突變

2.2 基因突變情況 132例白族、102例彝族非綜合征型耳聾患者SLC26A4基因總突變率分別為9.09%和11.76%，其突變位點和突變方式見表1。281C→T，589G→A，1226G→A，1975G →C，2162C→T，2168A→G位點在白族、彝族被檢人群中未發現有突變。

2.3 影像學檢查 顳骨薄層高分辨率CT及頭顱MRI檢查，針對篩查出SLC26A4基因突變的患者進行影像學結果分析，對應其CT及MRI結果顯示約42%的患者有前庭導水管擴大及內淋巴囊擴大(見圖2)，24例SLC26A4基因突變患者中有10例顳骨CT顯示雙側前庭導水管擴大及內淋巴囊擴大。

3 討論

大量研究表明前庭導水管擴大性耳聾與SLC26A4基因突變有密切相關。71.9%的大前庭導水管綜合征患者中可以發現SLC26A4基因突變，2%的正常人可攜帶SLC26A4基因突變，其影像學檢查結果多顯示前庭導水管或內淋巴囊擴大[1]。但耳聾基因突變在不同種族、不同地域有很大的差異[2]。因此研究云南地區少數民族耳聾患者易感基因的突變有重要意義。居住相對集中的白族和彝族人口基數大，取材相對其他少數民族較易，故針對白族和彝族耳聾人群基因進行調查分析。

表1 132例白族、102例彝族非綜合征型耳聾患者SLC26A4基因突變情況(例)

注：突變率是IVs7-2A→G與1229C→T的和/132而來。

圖2 A圖為CT示左側前庭導水管擴大明顯；B圖為MRI顯示左側內淋巴囊擴大

SLC26A4基因在中國突變頻率最高的類型是IVS7-2A>G(純合)[3]，IVS7-2A>G(雜合)[4](也稱作c.919-ZA>G)位于外顯子8剪切位點的位置，即內含子7的3’末端，其突變使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8整個丟失，外顯子7和外顯子9直接相連，從而導致Pendrin的翻譯發生移框或提前終止，影響Pendrin的結構和功能。袁永一等[5]在對263例大前庭導水管患者進行SLC26A4基因熱點突變區域篩查方案探討時發現，除了已知的IVS7-2A>G外，中國人群中SLC26A4基因熱點突變還包括IVSl5+5G→A，281C→T，2027T→A，589G→A，1174A→T，2168A→G，1226G→A，1229C→T，1975G→C，2162C→T。SLC26A4基因突變可導致前庭導水管擴大或伴其它內耳畸形。前庭導水管擴大綜合征患者其SLC26A4基因在不同地區和國家突變類型也不盡相同。該研究應用飛行時間質譜技術對云南地區白族、彝族非綜合征型耳聾人群SLC26A4基因的11個位點進行篩查，與其它基因檢測方法比較，具有高通量、準確、覆蓋率高、低成本等特點[7]。發現白族、彝族非綜合征型耳聾人群SLC26A4基因突變的主要位點是IVS7-2A>G。其SLC26A4基因純合突變的患者在聽力障礙方面發病時間不一，聽力損失水平也有極大的個體差異[8]，并且部分患者顳骨CT及MRI顯示前庭導水管擴大及內淋巴囊擴大，這在前庭導水管綜合征的分子病因及影像學診斷有高度一致性，對篩查出SLC26A4基因純合突變、復合雜合突變的患者進行聽力指導有重要意義。陳鑫蘋等[8]報道的IVS7-2A>G突變其顳骨CT前庭導水管的影像學表現并不一致，可能在致聾病因中，存在其他基因突變可能。針對此種情況，本研究就影像確診為前庭導水管綜合征，而未明確SLC26A4分子病因的患者，需進一步行直接測序，篩查是否存在新的突變位點，以待發現少數民族SLC26A4基因新的突變特征。本研究采用的是對常見的目的基因進行檢測，對發現少數民族耳聾基因新的突變位點存在缺陷，但是通過收集的病例檢測證實IVS7-2A>G也是白族、彝族的主要突變位點。王艷莉等[9]在寧夏336例非綜合征型聾學生中檢測到IVS7-2A>G和2168A>G(H723R)等位基因頻率分別為 9.08%和2.98%；賈婧杰等[10]在山東省濱州特教學校78名重度聾學生中檢測到SLC26A4 IVS7-2A>G的攜帶率為5.13%。本次研究白族SLC26A4基因IVS7-2A>G突變率6.06%，彝族SLC26A4基因IVS7-2A>G突變率5.88%，未檢出2168A>G(H723R)突變，IVS7-2A>G其突變率接近國內報道水平。由于耳聾病因學非常復雜，涉及的相關基因也非常之多，需要更多的臨床數據歸類總結。本次數據結果是針對昆明市兒童醫院耳鼻喉科門診就診的散發白族、彝族耳聾患者，在今后的研究中需進一步補充數據。在臨床中針對篩查出攜帶致聾基因突變的人群，對其婚配、用藥和聽力損失防護等方面可進行很好的干預和指導[11]。

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