重慶地區兒童珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷分析*

孟凡飛，李 毅，蒲曉允(第三軍醫大學新橋醫院檢驗科，重慶 400037)

珠蛋白生成障礙性貧血，是一組由于珠蛋白基因缺失或缺陷而引起珠蛋白合成障礙所致的遺傳性溶血性貧血疾病[1]，較為常見的有α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血，分子流行病學資料表明該病在世界各地的發病存在明顯的地理分布差異性，主要以熱帶及亞熱帶瘧疾高發區為主，在我國則主要集中在廣東、廣西及周邊省份。由于重慶地區人口基數大，流動人口多，病例數也不少，加強珠蛋白生成障礙性貧血的篩查對優生優育有重大意義[2]。為初步了解該地區珠蛋白生成障礙性貧血患兒的發生率及基因突變類型，本研究對2014年07月～2016年3月到本院就診的566例貧血患兒進行珠蛋白生成障礙性貧血篩查和基因檢測分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年7月～2016年3月在本院就診的經篩選疑似珠蛋白生成障礙性貧血患兒566例，其中男性314例，女性252例，年齡0～15歲，平均年齡3.2歲(標準差為2.7歲)。

篩選標準為：采用全自動血細胞分析儀進行血常規分析。國際珠蛋白生成障礙性貧血協會[3]推薦使用的珠蛋白生成障礙性貧血篩查診斷截斷值(cutoff values)是MCV<79fl和MCH<27pg，國內實驗室MCV一般取值<80fl。

1.2 試劑與儀器 自動血細胞分析儀為希森美康XL2100型，血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，α-和β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)均由潮州凱普生物化學有限公司提供。Thermo NanoDrop1000分光光度計，ABI Veriti PCR擴增儀。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：采用EDTA-K2無菌真空抗凝管抽取2ml靜脈血并混勻，標本采集后立即送檢或保存，待測標本于-4℃保存不超過3天，-20℃保存不超過3個月。

1.3.2 DNA的提取、擴增和雜交：按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取全血DNA。用Thermo NanoDrop1000分光光度計測定DNA吸光度，A260 nm/A280nm比值為1.5～2.5。DNA濃度為20～40 ng/μl。分別按說明書進行α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血PCR擴增，α-珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷：診斷中國人常見的3種缺失型(--SEA，-α3.7和-α4.2)及2種突變型(CS，QS)。α-珠蛋白生成障礙性貧血PCR擴增反應條件：95℃ 15 min，98℃40 s，64℃70 s，72℃150 s，35個循環，最后72℃延伸5 min，即可得到擴增產物。β-地中海貧血基因診斷：診斷中國人群中常見的11種β珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型，包括CD41-42(-TCTT)，CD17(A→T)，IVS-2-654(C→T)，βE(G→A)，-28(A→G)，-29(A→G)，CD43(G→T)，CD71-72(+A)，CD27-28(+C)，CD14-15(+G)，IVS-1-1(G→T)。β-珠蛋白生成障礙性貧血PCR擴增反應條件：37℃ 5 min，94℃3 min，然后94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環，最后72℃延伸5 min。將擴增產物與標記有不同缺失或突變類型珠蛋白生成障礙性貧血基因探針的尼龍轉印膜在導流雜交儀上進行導流雜交，然后通過酶標與NBT/BCIP底物化學顯色對結果進行判讀。

1.4 統計學分析 采用SPSS 16. 0軟件進行分析，組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總體情況 在566例疑為珠蛋白生成障礙性貧血的患兒中，共檢出289例患者攜帶有珠蛋白生成障礙性貧血基因，檢出率為51.06%。其中α-珠蛋白生成障礙性貧血98例，占33.91%；β-珠蛋白生成障礙性貧血189例，占65.40%，明顯高于α-珠蛋白生成障礙性貧血檢出率，差異有統計學意義(χ2=115.362，P=0.000)；復合型珠蛋白生成障礙性貧血2例占0.69%，男女性患兒中檢出率分別為51.59%(162/314)和50.39%(127/252)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.393，P=0.546)。

2.2 α-珠蛋白生成障礙性貧血基因的篩查情況 見表1。

表1 α-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的分布(n=98)

2.3 β-珠蛋白生成障礙性貧血基因的篩查情況 見表2。

2.4 復合型珠蛋白生成障礙性貧血的基因篩查情況 --SEA /αα/CD17，-α3.7/αα/CD41-42各1例，共占珠蛋白生成障礙性貧血總數的0.69%。

3討論珠蛋白生成障礙性貧血又稱海洋性貧血，是一類染色體遺傳性缺陷所致蛋白鏈合成障礙性疾病[4]。根據患者血液學參數及臨床特征，又可分為輕型、中間型和重型。輕型輕度貧血患者可無癥狀，中間型輕度至中度貧血，患者大多可存活至成年，重型珠蛋白生成障礙性貧血新生兒出生數日即可出現貧血、肝脾腫大、黃疸，預后極其不良，要靠規范化的終身輸血聯合去鐵治療維持生命，這給家庭帶來沉重的精神和經濟負擔。因此，如何預防本病，特別是避免重型患兒的出生，是珠蛋白生成障礙性貧血高發地區預防工作的重點。本研究中通過血細胞參數對重慶地區566例疑似珠蛋白生成障礙性貧血患兒進行基因診斷分析，陽性289例，陽性率達51.06%。β-珠蛋白生成障礙性貧血陽性率(65.40%)明顯高于α-珠蛋白生成障礙性貧血(33.91%)，男女性患兒檢出率差異不明顯，與四川[5]報道一致而與兩廣地區則相反。提示珠蛋白生成障礙性貧血是造成本地區兒童貧血的主要原因。基因診斷分析結果也可為珠蛋白生成障礙性貧血預防工作提供參考。

表2 β-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的分布(n=189)

中國南方人群中α-珠蛋白基因缺陷主要分為以下三種：左側缺失型(-α4.2/αα)，右側缺失型(-α3.7/αα)和東南亞缺失型(--SEA/αα)。本研究98例α-珠蛋白生成障礙性貧血中，東南亞缺失型和右側缺失型構成比達到81.64%。提示重慶地區兒童α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型以東南亞型缺失(--SEA/αα)和右側缺失(-α3.7/αα)為主，遺傳異質性較小，與陳紅英等[5]結果相符。β-珠蛋白生成障礙性貧血是由于β珠蛋白基因突變所引發的β球蛋白合成性障礙所引發的慢性溶血性貧血。調控β蛋白合成的相關基因多位于11號染色體上。目前人類不同種族中已發現至少186種β-珠蛋白生成障礙性貧血突變基因[6]。本研究189例β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒共檢出12種基因突變類型，以CD41-42(-TCTT)68例、CD17(A→T)63例、IVS-2-654( C→T)30例為主，占83.18%。另外發現本地區兒童β-珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子和純合子占總β-珠蛋白生成障礙性貧血的13.64% (22/189)，表明重慶地區重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生干預需要加強。本次共檢出復合型珠蛋白生成障礙性貧血2例，在以往文獻中已見報道珠蛋白生成障礙性貧血目前尚無良好的根治方法，最有效的預防手段是防止重癥珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。在我國大部分地區，尤其在珠蛋白生成障礙性貧血廣泛流行的廣西、廣東、貴州、云南等地，醫療水平相對落后，珠蛋白生成障礙性貧血檢查的基因技術不能廣泛開展，因此建立簡單、快捷、經濟、有效的珠蛋白生成障礙性貧血初步篩查的手段，不僅能減輕珠蛋白生成障礙性貧血流行地區群眾的經濟負擔，還能有效預防并減少珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。

[1] Weatherall DJ．Hemoglobinopathies worldwide：present and future[J]．Curr Mol Med，2008，8(7)：592-599．

[2] 王 歡，劉 申，黃君富，等．953例重慶地區地中海貧血基因突變類型分析[J]．第三軍醫大學學報，2012，34(17)：1802-1804．

Wang H，Liu S，Huang JF，et al．The 953 case thalassemia gene mutation analysis of Chongqing[J].Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae，2012，34(17)：1802-1804．

[3] Modell B，Harris R，Lane B，et al．Informed choice in genetic screening for thalassaemia during pregnancy： audit from a national confidential inquiry[J]．BMJ，2000，320(7231)：337-341．

[4] 喻 晶，張 戀，劉曉翌，等．孕婦珠蛋白生成障礙性貧血的臨床血液學篩查指標分析[J]．現代檢驗醫學雜志，2013，28(1)：138-140．

Yu J，Zhang L，Liu XY，et al．Analysis of the hematological parameters of pregnant women with thalassaemia[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2013，28(1)：138-140．

[5] 陳紅英，鄒 艷，劉春艷，等．四川瀘州地區貧血患兒珠蛋白生成障礙性貧血篩查和基因診斷結果分析[J]．中國兒童保健雜志，2013，21(11)：1139-1141．

Chen HY，Zou Y，Liu CY，et al．Biochemical screening and genetic diagnosis of thalassemia in children with anemia from Luzhou[J].Chinese Journal of Child Health Care，2013，21(11)：1139-1141．

[6] 于 潔，憲 瑩，姚秀云，等．重慶市學齡前兒童α-地中海貧血的分子流行病學研究[J]．中華血液學雜志，2014，35(5)：419-423．

Yu J，Xian Y，Yao XY，et al．Prevalence and molecular analysis of α-thalassaemia in preschool children from Chongqing city[J].Chinese Journal of Hematology，2014，35(5)：419-423．