深圳地區(qū)兒童A群致病性鏈球菌感染流行現(xiàn)狀及M蛋白基因分型分析*

肖海軍，殷曉晴，張慧蓮，劉芹蘭(.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳 58000；.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院婦科，廣東深圳 5809)

A群鏈球菌(group Astreptococcus，GAS) 又稱釀膿鏈球菌，是引起兒童感染性疾病的重要致病菌。GAS感染除易引起咽炎、扁桃腺炎和皮膚化膿性感染外，還可引起嚴(yán)重的風(fēng)濕熱和腎小球腎炎等非化膿性疾病。近年來，全球GAS感染性疾病較嚴(yán)重[1，2]，已成為全球社會(huì)公共衛(wèi)生問題，且不同emm基因型的GAS致病性也不同。因此，了解GAS感染流行現(xiàn)狀及emm基因分型對其流行性研究具有重要意義。筆者就此對2014年3月～2015年12月臨床送檢的1 634例患兒標(biāo)本進(jìn)行了GAS感染現(xiàn)狀及emm基因分型分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2014年3月～2015年12月來本院門診和住院就診的急性咽炎、急性扁桃腺炎、風(fēng)濕熱、猩紅熱患兒咽拭子及皮膚化膿性感染傷口分泌物共1 634份。

1.2 儀器與試劑 5 ml/dl綿羊血TSA瓊脂由英國Oxoid公司提供；氧化酶、觸酶及0.4 u桿菌肽敏感試劑盒由青島海博生物技術(shù)有限公司提供；Vitek32全自動(dòng)微生物系統(tǒng)生化分析儀由法國biosMerieumx公司提供；基因擴(kuò)增試劑均由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心提供。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定：將咽拭子標(biāo)本震蕩混勻后接種于含5 ml/dl綿羊血TSA(胰大豆蛋白胨)瓊脂血平板上，放置于37℃5%～10%(v/v)CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～36h；挑取有透明溶血環(huán)的圓形單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，革蘭氏染色為革蘭氏陽性(G+)鏈球菌，氧化酶和觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，對可疑菌落以0.4 u桿菌肽敏感試驗(yàn)、Oxoid的乳膠凝集試驗(yàn)鑒定，Vitek32全自動(dòng)微生物系統(tǒng)生化分析儀最終鑒定為GAS，所有操作均按細(xì)菌鑒定手冊中的操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3.2 GAS基因組DNA提取：參照美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦方法：在平皿上用無菌接種環(huán)刮取新鮮生長的半環(huán)量的GAS培養(yǎng)物重懸于300 μl 0.85 g/dl的氯化鈉生理鹽水中，70℃水浴15 min，然后以5 000 r/min離心5 min棄去上清液，加50μl TE(10 mmol Tris，1 mmol EDTA，pH 8.0)，10 μl變?nèi)芫?3 000 U/ml)及2 μl玻璃質(zhì)酸酶(30 mg/ml)，混勻后37℃水浴30 min，100℃煮沸10 min后離心上清液即為GAS基因分型組DNA，立即進(jìn)行PCR或存儲(chǔ)在-20℃以備使用。

1.3.3 GAS emm基因的擴(kuò)增：根據(jù)emm基因5’端堿基組成特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：(F)TATTGGCTTAGAAAATTAA，(R)GCAAGTTCTTCAGC TTGTTT對GAS的M蛋白N末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：50μl反應(yīng)液中含有200μmol/L dNTP，濃度為20 μmol/L的引物1和引物2各1 μl，2 u Taq，25 μg DNA模板；30個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，最后1次循環(huán)72℃引物延伸5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的測序：以測序引物TATTCGCTTAGAAATTAAAAACAGG為引物進(jìn)行直接測序，委托廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心基因診斷室進(jìn)行測序。

1.3.5 序列分析：通過網(wǎng)絡(luò)用BLAST軟件分析所測序列與GenBank中序列的同源性(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，以判斷emm基因分型的結(jié)果，根據(jù)DNA序列同源性≥95%判為同一基因型的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡兒童GAS感染率 見表1。1 634例患兒標(biāo)本中共分離鑒定出61株GAS，檢出率為3.73%(61/1 634)，其中學(xué)齡前和學(xué)齡兒童分別檢出14株和47株，檢出率分別為22.95%(14/61)和77.05%(47/61)，學(xué)齡兒童GAS感染率明顯高于學(xué)齡前兒童，兩者結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.035，P<0.01)，但學(xué)齡兒童不同年齡段GAS感染率之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.572，P>0.05)。

表1 61例不同年齡兒童GAS感染率(%)

注：*為<3歲組與>3歲組比較；#為3～7歲組與>7歲組比較。

2.2 A群致病性GAS感染疾病分布 見表2。

表2 61株致病性GAS感染疾病分布

急性咽炎、化膿性扁桃體炎、急性風(fēng)濕熱及急性腎小球腎炎等疾病患兒GAS檢出率較高，以急性咽炎和化膿性扁桃體炎為最高，分別為34.43%(21/61)和27.87%(17/61)。

2.3 GAS emm基因分型分布情況 見表3。61株GAS菌株 emm基因分型中，基因型以emm l為主，占40.98%(25/61)，其次為emm 12，占29.51%(18/61)。

表3 61株GAS emm基因分型分布情況

3 討論

A群鏈球菌(group AStreptococcus，GAS)為G+鏈球菌，細(xì)菌壁含有多種蛋白抗原(M，T和R)、磷壁酸、及多糖抗原。GAS是兒童細(xì)菌性感染重要病原菌之一，主要可引起咽炎、扁桃體炎、猩紅熱及皮膚軟組織感染，反復(fù)感染可繼發(fā)風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、關(guān)節(jié)炎和急性腎小球腎炎等，應(yīng)充分重視。

以前認(rèn)為，GAS易感染3歲以上兒童，引起咽炎和扁桃體炎，3歲以下兒童GAS性咽炎和扁桃體炎不常見。但近幾年研究發(fā)現(xiàn)3歲以下嬰幼兒GAS感染引起的咽炎、扁桃體炎也日益增加[3]。本研究結(jié)果顯示，3歲以下兒童GAS感染也有一定比率，為22.95%，但明顯低于3歲以上學(xué)齡兒童的感染率(77.05%)，兩者感染率之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這可能與3歲以下兒童機(jī)體內(nèi)自身免疫機(jī)制還沒完全建立有關(guān)。由于GAS含多種毒素和酶類，其感染可導(dǎo)致人體多種局部化膿性和非化膿性炎癥。因此，提高對GAS感染嬰幼兒的認(rèn)識(shí)，對預(yù)防GAS感染嬰幼兒具有重要意義。而本區(qū)嬰幼兒GAS感染率略低于黎國強(qiáng)等[3]報(bào)道廣東省新興地區(qū)的23.5%，這除與不同地區(qū)嬰幼兒機(jī)體內(nèi)免疫力不同外，還可能與家長及一些早教機(jī)構(gòu)的照看方式不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，急性咽炎和急性化膿性扁桃體炎患兒GAS檢出率最高，高達(dá)27.86%～34.43%，略低于黎國強(qiáng)等[3]報(bào)道的28.5%～38.8%。由于GAS感染的發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜，而且GAS感染引起的風(fēng)濕熱、腎炎和壞死性筋膜炎等嚴(yán)重威脅人體的生命安全。因此，咽拭子GAS培養(yǎng)應(yīng)該廣泛應(yīng)用于可疑的急性咽炎和急性扁桃體炎患兒檢查中，建議最好將GAS培養(yǎng)納入急性咽炎和急性化膿性扁桃體炎患兒常規(guī)檢查項(xiàng)目之一，及早發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療，以防漏診和誤診。

GAS emm基因分型可了解GAS感染流行菌株的分布狀況，有利于選擇流行菌株，從而構(gòu)建適合本地基因工程疫苗的研究，制造相應(yīng)疫苗來防治病原菌感染。本研究結(jié)果顯示，61株GAS菌株emm基因分型中，以emm l和emm 12為主，分別為40.98%和29.51%。因此， GAS emm1和emm12基因類型可初步認(rèn)定為本地區(qū)目前兒童感染GAS流行菌株，與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道[3～10]均不一致，這說明了不同地區(qū)GAS 感染流行的emm基因型均不相同。不同地區(qū)都應(yīng)該進(jìn)行GAS emm基因型的相關(guān)調(diào)查分析，為各地預(yù)防GAS感染流行的基因疫苗工程研究提供科學(xué)依據(jù)。

綜以上述，深圳地區(qū)兒童GAS感染有一定的檢出率，且3歲以下嬰幼兒也有較高的GAS檢出率，應(yīng)引起當(dāng)?shù)蒯t(yī)療行政部門高度重視。GAS emm1和emm12基因型可初步認(rèn)定本地區(qū)目前兒童感染GAS流行菌株，在臨床治療和預(yù)防過程中，除安全合理選用抗生素外，還要定期對高發(fā)區(qū)和易感人群進(jìn)行鏈球菌感染普查，根據(jù)GAS emm基因型分型研究開發(fā)一種安全有效的GAS疫苗，為本地區(qū)GAS疫苗研制提供依據(jù)。

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