馬錢子堿對人慢性粒細胞白血病KCL-22細胞的增殖及凋亡作用*

韓澤平，謝杏儀，何金花，黎毓光，呂鈺冰，周嘉彬

(廣州市番禺區中心醫院檢驗科，廣州 511400)

傳統中藥馬錢子(又名番木鱉)，是馬錢子科植物馬錢子的干燥成熟種子，具有抗炎消腫，散結活血，通絡止痛等功效，臨床廣泛應用于各種風濕頑痹、骨病和腫瘤以及癌性疼痛等治療[1]。馬錢子堿(Brucine)是從馬錢子中提取的吲哚型結構的生物堿，是馬錢子組成和發揮藥效的主要成分之一。研究發現，馬錢子堿不僅可在體外顯著地抑制多種細胞增殖，誘導肝癌、乳腺癌、結腸癌、多發性骨髓瘤等多種癌細胞產生凋亡[2]，而且動物實驗表明馬錢子堿也可有效地抑制體內腫瘤的生長和轉移[3，4]，成為近年來抗腫瘤藥物研究的一個熱點。本實驗旨在研究馬錢子堿在體外對人慢性粒細胞白血病細胞株KCL-22細胞的增殖及凋亡作用，為臨床治療白血病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥物 胎牛血清、RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)，Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(美國ABGAB公司)，多克隆兔抗人細胞色素C(Cyt-C)，Caspase-3，Caspase-9(美國Santa Cruz公司)，Bcl-2，Bax為鼠抗人單克隆抗體(美國Cell signal公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體及二抗(辣根過氧化物酶鏈接的抗鼠IgG、辣根過氧化物酶鏈接的抗兔IgG)均購于武漢博士德生物工程有限公司。MTS細胞增殖檢測試劑盒購自Promega，Westem細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天生物制品有限公司。馬錢子堿標準品，購自北京中國藥品生物制品檢定所(規格：20 mg/支，批號：110706-201306)。

1.2 細胞培養及藥物處理 人慢性粒細胞白血病KCL-22細胞株由中山大學腫瘤防治中心惠贈。用含10 ml胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI 1640培養液培養細胞，置于5 ml/dl CO2，37℃，飽和濕度培養箱中傳代培養，每2～3天換液傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。馬錢子堿標準對照品(20 mg/支)，為白色粉末狀制劑，加入少許濃鹽酸，待馬錢子堿完全溶解后加入12.625 ml無血清RPMI 1640培養液，配制成濃度為1.280 mg/ml的儲存液，用NaOH溶液調節pH值為7.2～7.4，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌后，4℃保存備用。

1.3 MTS法檢測細胞增殖 收集KCL-22細胞，RPMI 1640完全培養液重懸，接種于96孔板，使細胞密度為5×104/ml，每孔100 μl。設調零組(不接種細胞)、對照組(終濃度為0 μg/ml馬錢子堿)與不同濃度的實驗組(馬錢子堿終質量濃度分別為50，100，200，400 μg/ml)，每組設3個平行孔。置于培養箱中培養，24，48，72 h后加入MTS 試劑10 μl/孔，37℃避光孵育2 h，用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度，計算細胞抑制率。抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書。收集經過0～400 μg/ml馬錢子堿處理48 h的KCL-22細胞，PBS洗滌2次，用1×Binding buffer重懸，使細胞密度為1×106/ml，吸取400 μl細胞懸液分別移入5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15 min，繼續加入5 μl PI混勻后室溫避光孵育5 min，迅速加入400 μl 1×binding buffer，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡狀態。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達 分別收集終濃度為0，50，100，200，400 μg/ml馬錢子堿作用48 h后的KCL-22細胞，PBS液洗3次。加入100 μl蛋白裂解液冰上裂解細胞30 min，4℃ 12 000 r/min，離心15 min，收集上清液，運用蛋白質定量試劑盒BCA法蛋白定量。12 g/dl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，轉膜到醋酸纖維膜(NC)上。轉膜成功后，50 g/L脫脂奶封閉1 h，分別加入一抗Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，Cyt-C和β-actin，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL發光試劑后在暗室曝光、顯影、照相及結果分析。

2 結果

2.1 馬錢子堿對KCL-22細胞增殖的抑制作用 馬錢子堿對白血病KCL-22細胞的增殖有明顯的抑制作用。0～400 μg/ml馬錢子堿抑制作用隨藥物濃度的增高和作用時間的延長而增大，呈明顯的劑量和時間依賴性，各實驗組(50，100，200，400 μg/ml)與對照組(0 μg/ml)相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的馬錢子堿作用24，48，72h后對白血病KCL-22細胞的增殖抑制影響

2.2 馬錢子堿對白血病KCL-22細胞的凋亡作用 不同濃度的馬錢子堿作用白血病KCL-22細胞48 h后，運用流式細胞術Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡狀況，見圖2A。經馬錢子堿(0，50，100，200，400 μg/ml)作用后，KCL-22細胞的凋亡率分別為(1.2±0.25)%，(21.4±1.1)%，(35.2±2.71)%，(52.8±3.03)%和(68.6±2.87)%，凋亡率隨著馬錢子堿濃度的增加而逐漸上升(P<0.05)。其中，以早期細胞凋亡現象最為明顯，并呈濃度依賴性，早期凋亡率達(50.7±1.4)%，見圖2B。

2.3 細胞凋亡的信號通路檢測 Western blotting結果顯示，馬錢子堿作用48 h后，KCL-22細胞內Pro-Caspase-9和Pro-Caspase-3隨著藥物濃度的增加表達減弱，并逐漸出現切割活化條帶Cleaved-Caspase-9，Cleaved-Caspase-3。Cyt-C蛋白的表達水平隨藥物濃度增高而顯著上升，呈現藥物濃度依賴性。進一步檢測馬錢子堿對線粒體凋亡途徑相關蛋白Bcl-2，Bax表達的變化。結果表明，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達隨藥物濃度增加而減少，而Bax蛋白的表達卻呈上升趨勢，見圖3。

A：流式細胞術檢測細胞凋亡代表圖；B：KCL-22細胞早期凋亡率。1)：對照組．馬錢子堿終濃度0 μg/ml；2)：馬錢子堿終濃度 50 μg/ml；3)：馬錢子堿終濃度100 μg/ml；4)：馬錢子堿終濃度200 μg/ml；5)：馬錢子堿終濃度400 μg/ml；*與對照組比較，P<0.05。

3討論腫瘤細胞可通過逃脫程序性細胞死亡而實現惡性增殖[5]。因此，了解程序性細胞死亡的機制并設計誘導腫瘤細胞程序性死亡的治療方法對治療腫瘤尤為重要。慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML) 是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，表現為大量的不成熟白細胞數量增加，導致機體出現貧血、出血、感染及器官浸潤等癥狀，主要發病在青壯年群體[6]。化療是治療CML的主要手段，然而，目前一線化療藥物治療的效果并不理想，唯一治愈的方法是造血干細胞移植，但造血干細胞的供者缺少且治療費用極高，因此尋找更為高效、低毒的治療藥物成為了燃眉之急。近年來，中藥在抗腫瘤方面取得了很好的療效，利用中藥及其提取物治療白血病，已經日益受到廣泛重視。

圖3 Western blotting法檢測不同濃度馬錢子堿處理KCL-22細胞后凋亡相關蛋白的表達

馬錢子堿是從傳統中藥馬錢子中提取的吲哚型結構的生物堿，體外研究發現，馬錢子堿可顯著抑制多種細胞的增殖，是近年來抗腫瘤研究較多的一種中藥成分。已證實，馬錢子堿具有抗多種血液腫瘤作用，且在一定范圍內其作用呈劑量和時間依賴性[7～9]。本研究以慢性粒細胞白血病KCL-22細胞作為研究對象，探討馬錢子堿對其的作用。MTS結果顯示，不同濃度馬錢子堿對KCL-22細胞有不同程度的抑制作用，且抑制率隨馬錢子堿濃度的增大而升高，隨作用時間的延長而升高，呈現明顯的時間-劑量依賴性。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，又稱I型程序性細胞死亡(program rtled cell death，PCD)，是近年來腫瘤治療研究的熱點之一。本研究運用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術證實了馬錢子堿對KCL-22細胞的誘導凋亡作用，客觀地顯示了在0～400 μg/ml濃度范圍內馬錢子堿濃度與凋亡率的劑量效應關系。值得注意的是，馬錢子堿以誘導細胞早期凋亡為主，并隨著藥物濃度的增強，早期凋亡率在一定范圍內逐漸上升(圖2)。Bcl-2家族蛋白作為細胞凋亡的重要調控因子，其主要作用部位是線粒體外膜[10]。研究表明[11]，一般狀態下易位到線粒體的Bax不斷被線粒體上的Bcl-2等抗凋亡蛋白移回細胞質從而保證線粒體外膜正常的通透性。當細胞受凋亡信號刺激后，線粒體膜上的Bcl-2減少，引起Bax /Bcl-2比率增加，線粒體外膜通透性增大，使線粒體內的促凋亡物質Cyt-C等釋放到包漿中，激活Caspase家族。Caspase家族蛋白的激活在細胞凋亡過程中扮演著重要角色，被認為是誘發凋亡的直接效應物。生理狀態下Caspase以無活性的前體形式存在，在凋亡信號刺激下，線粒體膜通透性升高釋放Cyt-C與Caspase-9前體形成凋亡小體的復合體，通過凋亡小體對線粒體通路的Caspase-9進行募集和自切割活化活化的Caspase-9切割活化下游的Caspase-3激活級聯反應，活化的Caspase-3能裂解DNA，使DNA片段化，最終導致細胞凋亡出現形態學和生物學的改變[12]，達到抑制細胞的增殖、促進細胞凋亡的效果。本研究的結果表明，在馬錢子堿誘導KCL-22細胞凋亡的過程中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達隨著藥物濃度的增加而遞減，而凋亡蛋白Bax則相反，使得Bax/Bcl-2的比率增加，促使Cyt-C的釋放，Cyt-C的表達量呈現劑量依賴的趨勢，最終導致Caspase-9，Caspase-3被切割活化，提示馬錢子堿可能通過調節Bax/Bcl-2，釋放Cty-C，激活Caspase-9，Caspase-3依賴的內源性線粒體途徑誘導KCL-22細胞發生不可逆凋亡。

綜上所述，馬錢子堿處理后可抑制慢性白血病KCL-22細胞增殖，并促進其凋亡，這種作用可能是通過調控Bax/Bcl-2平衡、釋放Cyt-C及激活Caspase-9，Caspase-3實現的。我們將進一步探討馬錢子堿誘導KCL-22細胞凋亡的分子機制，為慢性粒細胞白血病的治療提供新的思路和資料，也可更好地為臨床治療提供參考和幫助。

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