老年哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中粒細胞巨噬細胞集落刺激因子水平變化及意義*

楊曉紅，徐慶雷，馬小波，張 巍，劉玲玲，王加平

(1.沭陽縣人民醫院檢驗科，江蘇沭陽 223600；2.東海縣人民醫院檢驗科，江蘇東海 222300)

支氣管哮喘(哮喘病)是一種嚴重影響人類健康的疾病。研究證實，哮喘病是一種以呼吸道炎癥為病理基礎的慢性氣道炎癥性疾病，中性粒細胞等多種細胞和細胞因子參與其中[1～3]。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是具有直接趨化中性粒細胞作用的細胞因子，可招募、激活中性粒細胞[4，5]。髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)屬于亞鐵血紅素酶，在中性粒細胞中含量較恒定，是與氧化應激關聯的細胞因子[6]。本研究以老年哮喘患者為研究對象，檢測其支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中GM-CSF和MPO的水平及中性粒細胞比例，探討GM-CSF在老年哮喘發生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 哮喘急性發作期老年哮喘患者39例，為2015年1月～12月在沭陽縣人民醫院呼吸科門診及住院就診患者，其中男性20例，女性19例，平均年齡62±7歲。哮喘患者入選標準：①診斷依據中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的“支氣管哮喘防治指南”的診斷標準[7]；②按照“全球哮喘防治創議”(GINA)方案[8]判斷哮喘急性發作嚴重程度。③72 h內未使用糖皮質激素、受體興奮劑及茶堿類等藥物。

對照組為同期因支氣管異物住院的患者，共35例，其中男性18例，女性17例，平均年齡59±6歲。排除免疫性及過敏性疾病，近期無感染和慢性疾病史。以上各組患者均簽署知情同意書后行纖維支氣管鏡術及支氣管肺泡灌洗術(BAL)，同時獲沭陽縣人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器與主要試劑 酶標儀采用美國Bio-Tek Instruments公司uQuant型，GM-CSF和MPO試劑購自美國RB公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集和處理：39例急性發作期老年哮喘患者分別于入院給予常規抗哮喘治療，癥狀緩解1天后及經過3～6月的控制治療后病情穩定，癥狀、體征消失并被確診為臨床緩解時采集標本。在完成支氣管術檢查后行肺泡灌洗術。第1次灌洗所得BALF送檢病原學培養，其余灌洗液混勻，1 500 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，沉渣用于細胞學分析，上清液置于-70℃保存用于GM-CSF和MPO檢測。

1.3.2 細胞學檢查：采用計數池法對BALF沉渣進行細胞計數，涂片法進行細胞分類計數，瑞氏染色法對沉渣涂片進行染色，每張涂片計數500個細胞，取兩張涂片的平均值。

1.3.3 GM-CSF和MPO檢測：采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測GM-CSF和MPO，按照說明書進行操作，酶標儀檢測樣本吸光度值，通過標準曲線計算樣本濃度值。

2 結果

2.1 老年哮喘患者BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率與對照組比較 見表1。

表1 老年哮喘患者BALF中GM-CSF和MPO水平及中性粒細胞百分率比較

老年哮喘患者急性發作期、緩解期以及對照組BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率在三組間的差異均有統計學意義(F=45.78～69.21，P均=0.000)。經兩兩比較發現，老年哮喘患者急性發作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率顯著高于緩解期及對照組，差異有統計學意義(t=5.127～9.080，P均<0.01)；老年哮喘患者緩解期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分比與對照組比較，差異均無統計學意義(t=1.153～1.840，P均>0.05)。

2.2 哮喘患者發作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率相關性分析 采用直線相關分析老年哮喘患者急性發作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率之間的相關性，結果顯示GM-CSF和NEU百分率之間呈正相關(r=0.554，P=0.005)，見圖1。NEU百分率和MPO水平之間呈正相關(r=0.569，P=0.004)，見圖2。GM-CSF和MPO水平之間呈正相關(r=0.725，P=0.000)，見圖3。

圖1 老年哮喘患者急性發作期BALF中GM-CSF和NEU百分率相關性分析

圖2 老年哮喘患者急性發作期BALF中NEU百分率與MPO水平相關性分析

圖3 老年哮喘患者急性發作期BALF中GM-CSF水平與MPO水平相關性分析

3 討論

GM-CSF是由內皮細胞等在細菌脂多糖(LPS)、白細胞介素-1(IL-1)和TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌的一種細胞因子，屬于糖蛋白，分子量24-33kDa。GM-CSF介導炎性反應，發揮多種重要功能，可趨化、激活中性粒細胞。體外試驗證實GM-CSF能誘導中性粒細胞發生遷移，體內研究發現GM-CSF可招募并誘導中性粒細胞向血管外遷移[5]。GM-CSF還可以激活中性粒細胞并能提高中性粒細胞壽命和存活能力[9，10]。支氣管上皮細胞能分泌GM-CSF來維持中性粒細胞的存活、減緩中性粒細胞的凋亡[11]。新近的研究發現GM-CSF參與哮喘的發生和發展，表皮生長因子受體(EGFR)能調節氣道上皮細胞(AEC)對GM-CSF的分泌，提示EGFR/GM-CSF軸可成為治療哮喘的新靶點[12]。Lee等[13]的研究表明，1，8-桉油素對支氣管上皮細胞分泌GM-CSF具有抑制作用，能降低哮喘小鼠的氣道高反應性(AHR)并減輕其炎癥反應。本研究結果顯示老年哮喘患者BALF中GM-CSF水平在急性發作期升高，提示GM-CSF在哮喘急性發作過程中起著重要作用，GM-CSF可使中性粒細胞向氣道局部聚集，并將其激活，促進氣道炎癥的發展。本研究首次探討GM-CSF在老年哮喘患者BALF中水平的變化，既往未見報道。

中性粒細胞在哮喘的發病機制中起著重要作用，參與氣道炎癥的發生發展[14]。MPO是中性粒細胞的活化標志[15]。MPO是由兩個分子量均為73kDa的單體通過胱氨酸連接成的二聚體，是一種血紅素蛋白的過氧化物酶類。由活化的中性粒細胞釋放。MPO參與多種疾病的發生、發展，能使細胞膜的不飽和脂肪酸發生氧化級聯反應，導致脂質過氧化造成細胞損傷[16，17]。動物研究證實在哮喘大鼠的肺組織切片中支氣管壁及血管壁周圍MPO陽性表達的細胞數明顯增高，表明MPO參與了哮喘的發病機制[18]。本研究結果顯示哮喘患者急性發作期BALF中中性粒細胞比例和MPO水平增高，佐證了這一結果。提示中性粒細胞在氣道的聚集與活化參與了哮喘的急性發作過程，同時也支持MPO參與哮喘的發生、發展相關之觀點。

本研究結果提示，GM-CSF參與哮喘的發病過程。其機制可能是GM-CSF促進中性粒細胞在氣道局部聚集并將其激活，活化的中性粒細胞釋放MPO等多種酶類進而發生病理反應。GM-CSF可作為哮喘患者病情監測的有效指標，尚需通過大樣本進一步研究證實。

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