尿液HCMV DNA檢測在兒童HCMV感染中的臨床應用*

張 華，詹 頡，趙 海，蘇寶鳳，蒼金榮，宮艷艷，劉培培，楊瑞雪

(陜西省人民醫院檢驗科，西安 710068)

人巨細胞病毒(HCMV)屬皰疹病毒科，其感染人體后使感染細胞腫大并產生巨大的核內嗜酸性包涵體故稱為巨細胞病毒。人群對CMV普遍易感，但大多數免疫正常個體出現無癥狀感染，而新生兒和嬰幼兒因抵抗力較弱，感染后可出現明顯癥狀。現對我院2014年1月～2015年12月收集的1 492例尿液標本HCMV DNA結果進行回顧性分析研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年1月～2015年12月本院兒科及新生兒科住院的疑似人巨細胞病毒感染的患兒尿液標本1 492例，年齡0～12歲，其中新生兒(0～3月)78例，嬰幼兒(3月～3歲)981例，學齡前兒童(3～6歲)249例，學齡期兒童(6～12歲)184例；收集的標本保存于4℃冰箱，48h內完成檢測。

1.2 儀器與試劑 PCR擴增儀采用美國通用公司ABI 7500全自動實時熒光定量PCR擴增儀，按要求對儀器定期校驗和維護；HCMV DNA檢測試劑盒由上海復星長征醫學科學有限公司提供，有生產許可證及嚴格的防污染技術。實驗全過程遵守臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范，實驗操作人員要求持證上崗，嚴格按照標準操作程序進行操作。

1.3 檢測原理 本品選取人巨細胞病毒株高度保守的非編碼區為擴增的靶區域，設計特異性引物及熒光探針，利用實時熒光定量PCR技術，檢測尿液樣本中人巨細胞病毒DNA。

1.4 檢測方法 尿液混合均勻取1 000 μl，13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀中加入1 000μl生理鹽水重新懸浮，13 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入50 μl裂解液，混勻后100℃加熱10 min，13 000 r/min離心2 min，取4 μl上清液作為模板加入PCR反應液上機擴增。循環參數：50℃ 2 min；94℃ 5 min；再按94℃ 10s～60℃ 45 s循環40次，60℃采集熒光。

1.5 結果判斷 在陰陽性對照和室內質控合格的情況下，Ct值小于38為陽性，Ct值大于40為陰性，對Ct值介于38～40的灰區標本按要求復檢，如檢測結果仍介于38～40之間則判斷為陽性，否則為陰性。

1.6 統計學方法 計數資料應用配對χ2檢驗，采用SPSS13.0統計軟件處理，以a=0.05為水準，即P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1、表2。新生兒組、嬰幼兒組、學齡前組和學齡期組各種疾病時HCMV DNA檢測結果之間比較χ2=9.253～23.452，P均<0.01。其中學齡期組與新生兒組比較χ2=23.452，P<0.001，差異有顯著或非常顯著的統計學意義；而表2的患兒幾種常見疾病組中，肝功能異常組、支氣管肺炎組和發熱組之間χ2=0.356～0.865，P均>0.05，差異無統計學意義，而這三組與早產兒組和高膽紅素血癥組比較χ2=13.231，P均<0.01，差異有統計學意義。

表1 各年齡段HCMV DNA陽性的分布

表2 患兒常見疾病HCMV DNA陽性分布(n=1 482)

3 討論

人類巨細胞病毒(HCMV)為臨床常見的病原體，是新生兒和嬰幼兒最常見的感染性疾病之一，其感染情況的臨床表現多樣化，幾乎覆蓋所有的重要器官，包括肺、肝、腎臟、骨髓、唾液腺、心臟和大腦，免疫力低下的患兒甚至引起多臟器損害[2]。在美國HCMV的感染率約為50%～70%，但是在發展中國家其感染率超過90%。在我國CMV抗體陽性率90%以上，即90%以上人群感染過CMV，大多數為無癥狀潛伏感染[3]。盡管HCMV在健康人群中基本無致病性，但是先天感染HCMV可導致新生兒神經系統缺陷，特別是免疫系統尚未成熟的新生兒初始和反復感染HCMV可導致嚴重疾病如肺炎、肝炎以及胃腸道相關疾病。

本結果顯示在HCMV DNA陽性的291例患兒中，新生兒的HCMV-DNA陽性率最高(38.5%)，其次為嬰幼兒(22.0%)，即隨著年齡的遞增HCMV DNA陽性率呈下降趨勢，到學齡期兒童的感染率最低(4.9%)，各組之間均有統計學差異(P<0.01或P<0.001)。說明HCMV感染與患兒的年齡和免疫狀態密切相關，新生兒由于免疫系統尚未健全HCMV DNA陽性率較高，3歲以后逐漸下降，即隨著年齡的增長自身免疫系統逐漸完善，其HCMV的感染率逐漸下降，在學齡期兒童的感染率降為最低。新生兒的高感染率說明CMV感染途徑主要為宮內感染和圍產期感染，出生后感染次之。然而在孕婦原發或繼發感染后，病毒通過胎盤直接感染胎盤滋養細胞和結締組織細胞，而后到胎兒體內引起宮內感染[4，6]是新生兒高感染率的主要因素；而圍產期感染可能經產道和母乳等途徑獲得。

在不同疾病組中，早產兒和高膽紅素血癥患兒的HCMV DNA陽性率最高(分別為43.5%和38.2%)，與其他組比較均有統計學顯著性差異(P<0.01)，其余各組(肝功能異常、支氣管肺炎患兒和發熱等)之間均差異無統計學意義(P>0.05)。早產兒和高膽紅素血癥的HCMV高感染率基本和患兒的年齡有關，因為高膽紅素血癥的患兒基本都是新生兒，但是高感染率的HCMV是否導致胎兒的早產還有待于進一步研究。肝功異常、支氣管肺炎和發熱均有一定的HCMV感染率，這可能與HCMV感染導致全身多器官多系統損害，特別是累及肝臟和肺臟，其特點與有關報道相符合[5]。不過由于HCMV宮內感染引起胎盤功能出現異常，患兒缺氧、缺乏營養物質導致一系列代償反應而導致早產，HCMV容易侵犯管道上皮細胞故引起患兒高膽紅素血癥、支氣管肺炎和肝功能損害，但HCMV感染是否可直接導致患兒高膽紅素血癥和肝功損害其機制仍處于推測階段，尚需進一步研究。

本研究結果顯示新生兒和嬰幼兒是人巨細胞病毒感染的高發人群，其中的早產兒和高膽紅素血癥患兒的HCMV DNA檢出率高應引起重視。目前HCMV感染的實驗室診斷方法較多，而HCMV DNA陽性是HCMV感染最直接的證據。而該研究利用回顧性分析方法，采用FQ-PCR技術檢測1 492例疑似人巨細胞病毒感染的患兒尿液樣本中的HCMV DNA，總檢出率為19.5%(291/1 492)，低于相關文獻報道的30%～40%，原因可能是本研究中統計樣本時去除了反復檢測的患兒，而且尿液樣本的留取和保存影響因素較多，也不能排除地域差異。研究顯示不同的樣本類型會對FQ-PCR檢測結果有直接影響，但是由于尿液樣本簡單易得，FQ-PCR技術靈敏度高，特異性強，特別是對于新生兒嬰幼兒采集尿液樣本比采集血液等相關樣本更為快捷和方便，而且患兒無創傷，因此尿液HCMV DNA檢測對患兒HCMV感染及相關疾病的診斷和治療具有重要意義。

[1] 李金明．實時熒光PCR技術[M]．北京：人民軍醫出版社，2011：256-271．

Li JM．Real-time PCR[M]．Beijing：People’s Medical Publishing House，2011：256-271．

[2] 尚世強，陶 然．兒童巨細胞病毒感染的診斷[J]．實用兒科臨床雜志，2006，21(22)：1598-1600．

Shang SQ，Tao R．Diagnosis of cytomegalovirus infection in children[J]．Journal of Applied Clinical Pediatrics，2006，21(22)：1598-1600．

[3] 方風琴，季育華．人巨細胞病毒潛伏激活研究新進展[J]．檢驗醫學，2010，25(3)：240-243．

Fang FQ，Ji YH．New progress in the study of latent activation of human cytomegalovirus[J]．Laboratory Medicine，2010，25(3)：240-243．

[4] 蔣祥林，鄒 飛．小兒巨細胞病毒感染致病特點及診治進展[J]．現代醫藥衛生，2012，28(4)：556-557．

Jiang XL，Zou F．Pathogenic characteristics and progress of diagnosis and treatment of cytomegalovirus infection in children[J]．Modern Medicine and Health，2012，28(4)：556-557．

[5] Abu Faddan N，Eltayeb A，Refaiy A．Cytomegalo virus as a possible risk factor for neonatal gastrointestinal surgical conditions[J]．Fetal Pediatr Pathol，2011，30(2)：124-129．

[6] 張 琳，王淮燕．新生兒先天性巨細胞病毒感染的研究進展[J]．現代預防醫學，2013，40(16)：3031-3033．

Zhang L，Wang HY．Research progress of congenital cytomegalovirus infection in neonates[J]．Modern Preventive Medicine，2013，40(16)：3031-3033．

[7] 沈鳳賢，呂時銘．妊娠期巨細胞病毒感染診斷研究進展[J]．國際婦產科學雜志，2013，2(40)：10-13，20．