李騰達，劉 鵬，谷明莉，鄧順江，吳林洪，葉 辛，劉 云，張薇薇，錢 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫大學長海醫院，上海 200433；2.解放軍100醫院，江蘇蘇州 215007)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性疾病，其特點是針對自身抗體敏感的血小板清除加快，產生量相對不足，血小板總量減少[1]。在ITP中，激活的自身免疫性T細胞增多，IFN-γ，IL-2等Th1型細胞因子與IL-17等Th17型細胞因子增多，與疾病嚴重程度相關[2]。而在T細胞適應性免疫過程中上游固有免疫Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)扮演了重要角色，它能夠在免疫系統受到病原體攻擊時快速識別一系列病原體相關模式分子[1]。ITP病人中TLRs信號通路的激活能增強促炎因子如IL-6，TNF-α等表達，從而使機體更有利于調動適應性免疫過程[1]。

CD93(也叫C1qRp)，是一種跨膜糖蛋白，表達于單核細胞、表皮細胞等細胞表面，溶解形式為sCD93，與細胞黏附和吞噬作用密切相關[3]。有報道顯示CD93能誘導單核細胞分化為巨噬細胞，擴大TLR通路反應和促炎因子如TNF-α的產生[4]。近來CD93在自身免疫疾病中的作用逐漸突顯，在系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)中，血清中sCD93升高，與TLR配體、TNF-α表達相關[5]；在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)與骨關節炎的對照研究中，sCD93在RA中顯著上升，與疾病形成相關[4]。然而，在ITP中CD93的作用機制尚未明確，本文通過分析sCD93在病人血漿中的表達水平及其與TNF-α等細胞因子的相關性，為進一步研究CD93在ITP疾病形成過程中的生物學作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象 實驗組為34例2012年5月～2015年8月在上海長海醫院血液科確診ITP患者，其中新診患者19例，慢性患者15例，男性14例，女性20例，平均年齡34.4±17.8歲。新診斷患者為新確診ITP病人，且之前無可靠的臨床或實驗室確診證據；慢性患者為已經確診為ITP且持續12月以上的病人。對照組34例為同期體檢的健康個體，男性16例，女性18例，平均年齡36.8±18.9歲，兩組間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經第二軍醫大學長海醫院醫學科研倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)，酶標儀(Thermo Scientific公司)，生物分光光度計(德國Eppendorf公司)，離心機(上海戴寶)。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集及PBMC的分離：抽取研究對象2 ml左右的EDTA-K2抗凝無菌外周血，3 000 r/min離心10 min后，將血漿轉移至EP管中于-80℃凍存。

1.3.2 ELISA法檢測血漿sCD93及細胞因子的蛋白水平：按照ELISA試劑盒操作說明進行sCD93及相關細胞因子的檢測。如下：每個反應孔中加0.1 ml 1～10 μg/ml抗體稀釋液，4℃過夜。次日，棄孔內液，洗滌，加0.1 ml適宜濃度的樣本于反應孔中，37℃反應1 h后洗滌。加入0.1 ml酶標抗體，37℃，1 h后再洗滌。最后加TMB顯色，25 min后加2 mol/L硫酸終止反應，于450 nm處檢測。

1.4 統計學分析 兩組間連續性計量資料的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，sCD93與細胞因子的相關性以Pearson系數表示，檢驗水準為0.05。統計軟件為GraphPad Prism 6.0。

2 結果

2.1 實驗組與對照組血漿中sCD93的表達水平 實驗組血漿中sCD93蛋白水平為367.28±206.98 ng/ml，對照組為218.43±96.14 ng/ml，差異具有統計學意義(t=3.803，P=0.000 3)。

2.2 實驗組與對照組細胞因子的表達水平 見表1。

表1 實驗組與對照組細胞因子表達的比較

與對照組比較，實驗組血漿中TNF-α，IL-4，IL-17和IFN-γ蛋白表達量增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，其中TNF-α的表達量約為對照組的5倍，IFN-γ約為對照組的4倍，IL-4約為對照組的2倍。

2.3 實驗組sCD93與細胞因子的相關性分析 實驗組ITP患者血漿中sCD93與TNF-α，IL-17表達水平呈正相關，差異具有統計學意義(r=0.448,0.473；均P<0.05)；與IL-4，IFN-γ不具有相關性(r=0.198,0.245，均P>0.05)。

3 討論

ITP是一種基因異質性的血液疾病，不同群體有不同的致病原因、發病史和療效[1，6]。兒童ITP患者常有近期感染史[7]，成人ITP則常伴有人類免疫缺陷病毒、幽門螺旋桿菌、丙肝病毒等慢性感染[1]。ITP疾病常常伴有Th1，Th2，Th17細胞亞群的失調和Tregs，Bregs細胞的免疫缺陷[1，2]。研究顯示ITP病人中，針對血小板自身抗原的T細胞分泌IL-2，IFN-γ增加，這表明CD4+T細胞群的分化趨向于Th1細胞亞群。此外，Th17細胞與IL-17產量也增加，表明Th17可能參與了ITP的免疫病理過程[2，7]。固有免疫中單核細胞被認為是組織性巨噬細胞和樹突狀細胞的前身，在激活和極化自身免疫相關Th細胞方面有重要作用，實驗表明去除CD16+單核細胞能升高Treg細胞和Th17細胞，抑制Th1細胞。在ITP中，CD16+單核細胞能促進Th1細胞因子分泌，同時抑制Treg和Th17細胞[2]。而TLRs作為固有免疫反應的哨兵，在連接固有免疫和適應性免疫反應中起到了重要作用。最近有研究表明，血小板的TLRs能促進樹突狀細胞抗原提成，在適應性免疫反應中起到了重要作用，這表明在ITP等血小板相關性疾病中TLRs信號通路亦扮演了重要角色[1]。

CD93是一種跨膜糖蛋白，其細胞外結構包括C-型外源凝集素樣區域，系列EGF樣重復序列，高度糖基化黏蛋白樣區域，最近有研究表明CD93在調節凋亡細胞吞噬作用、維持組織穩態和損傷修復方面有重要作用[8]。研究表明CD93在上皮細胞的表達與血管重建相關，意味著其參與了血管重建過程，與急性炎癥、慢性炎癥反應相關[9，10]。在以THP-1為模型的細胞試驗中發現，CD93在單核細胞分化為巨噬細胞之前能促進LPS誘導的TNF-α的產生[4]。在試管試驗中發現，TNF-α或LPS的刺激能導致CD93從單核細胞釋放成為sCD93，而sCD93能擴大TLR介導的單核細胞產生細胞因子，從而提高單核細胞TLR通路的敏感度[5]，更有利于機體調動適應性免疫過程[1]。基于CD93在免疫調節方面的作用，其在自身免疫如SSc，RA中亦備受關注，然而其在ITP中的作用機制尚不明確，本研究發現sCD93在ITP中上升，且與IL-17，TNF-α呈正相關，證明其可能參與了ITP的免疫性致病過程，但本實驗樣本均來自同一地區，且樣本例數較少，有待擴大樣本進一步進行驗證和深入研究。

[1] Lazarus AH，Semple JW，Cines DB．Innate and adaptive immunity in immune thrombocytopenia[J]．Seminars in Hematology，2013，50(Suppl 1)：S68-S70．

[2] Yazdanbakhsh K，Zhong H，Bao W．Immune dysregulation in immune thrombocytopenia[J]．Seminars in Hematology，2013，50(Suppl 1)：S63-S67．

[3] Sigari N，Jalili A，Mahdawi L，et al．Soluble CD93 as a novel biomarker in asthma exacerbation[J]．Allergy Asthma & Immunology Research，2016，8(5)：461-465．

[4] Jeon JW，Jung JG，Shin EC，et al．Soluble CD93 induces differentiation of monocytes and enhances TLR responses[J]．Journal of Immunology，2010，185(8)：4921-4927．

[5] Yanaba K，Asano Y，Noda S，et al．Augmented production of soluble CD93 in patients with systemic sclerosis and clinical association with severity of skin sclerosis[J]．The British Journal of Dermatology，2012，167(3)：542-547．

[6] 葉 辛，石 磊，谷明莉，等．原發性免疫性血小板減少癥患者顆粒溶素、顆粒酶B、穿孔素的表達及臨床意義[J]．現代檢驗醫學雜志，2014，29(1)：20-23．

Ye X，Shi L，Gu ML，et al．Expression of granzyme B，granulysin and perforin from patients with primary immune thrombocytopenia[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2014，29(1)：20-23．

[7] Price V．Auto-immune lymphoproliferative disorder a-nd other secondary immune thrombocytopenias in childhood[J]．Pediatric Blood & Cancer，2013，60(Suppl 1)：S12-S14．

[8] Greenlee-Wacker MC，Galvan MD，Bohlson SS．CD9 3：recent advances and implications in disease[J]．Current Drug Targets，2012，13(3)：411-420．

[9] Liu C，Cui Z，Wang S，et al．CD93 and GIPC expression and localization during central nervous system inflammation[J]．Neural Regeneration Research，2014，9(22)：1995-2001．

[10] Galvagni F，Nardi F，Maida M，et al．CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration[J]．Oncotarget，2016，7(9)：10090-10103．