sCD93在免疫性血小板減少癥患者中表達(dá)升高及臨床意義*

李騰達(dá)，劉 鵬，谷明莉，鄧順江，吳林洪，葉 辛，劉 云，張薇薇，錢 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院，上海 200433；2.解放軍100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是針對自身抗體敏感的血小板清除加快，產(chǎn)生量相對不足，血小板總量減少[1]。在ITP中，激活的自身免疫性T細(xì)胞增多，IFN-γ，IL-2等Th1型細(xì)胞因子與IL-17等Th17型細(xì)胞因子增多，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。而在T細(xì)胞適應(yīng)性免疫過程中上游固有免疫Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)扮演了重要角色，它能夠在免疫系統(tǒng)受到病原體攻擊時快速識別一系列病原體相關(guān)模式分子[1]。ITP病人中TLRs信號通路的激活能增強(qiáng)促炎因子如IL-6，TNF-α等表達(dá)，從而使機(jī)體更有利于調(diào)動適應(yīng)性免疫過程[1]。

CD93(也叫C1qRp)，是一種跨膜糖蛋白，表達(dá)于單核細(xì)胞、表皮細(xì)胞等細(xì)胞表面，溶解形式為sCD93，與細(xì)胞黏附和吞噬作用密切相關(guān)[3]。有報(bào)道顯示CD93能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，擴(kuò)大TLR通路反應(yīng)和促炎因子如TNF-α的產(chǎn)生[4]。近來CD93在自身免疫疾病中的作用逐漸突顯，在系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)中，血清中sCD93升高，與TLR配體、TNF-α表達(dá)相關(guān)[5]；在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)與骨關(guān)節(jié)炎的對照研究中，sCD93在RA中顯著上升，與疾病形成相關(guān)[4]。然而，在ITP中CD93的作用機(jī)制尚未明確，本文通過分析sCD93在病人血漿中的表達(dá)水平及其與TNF-α等細(xì)胞因子的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究CD93在ITP疾病形成過程中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 實(shí)驗(yàn)組為34例2012年5月～2015年8月在上海長海醫(yī)院血液科確診ITP患者，其中新診患者19例，慢性患者15例，男性14例，女性20例，平均年齡34.4±17.8歲。新診斷患者為新確診ITP病人，且之前無可靠的臨床或?qū)嶒?yàn)室確診證據(jù)；慢性患者為已經(jīng)確診為ITP且持續(xù)12月以上的病人。對照組34例為同期體檢的健康個體，男性16例，女性18例，平均年齡36.8±18.9歲，兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)，生物分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)，離心機(jī)(上海戴寶)。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集及PBMC的分離：抽取研究對象2 ml左右的EDTA-K2抗凝無菌外周血，3 000 r/min離心10 min后，將血漿轉(zhuǎn)移至EP管中于-80℃凍存。

1.3.2 ELISA法檢測血漿sCD93及細(xì)胞因子的蛋白水平：按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行sCD93及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測。如下：每個反應(yīng)孔中加0.1 ml 1～10 μg/ml抗體稀釋液，4℃過夜。次日，棄孔內(nèi)液，洗滌，加0.1 ml適宜濃度的樣本于反應(yīng)孔中，37℃反應(yīng)1 h后洗滌。加入0.1 ml酶標(biāo)抗體，37℃，1 h后再洗滌。最后加TMB顯色，25 min后加2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，于450 nm處檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組間連續(xù)性計(jì)量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，sCD93與細(xì)胞因子的相關(guān)性以Pearson系數(shù)表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。統(tǒng)計(jì)軟件為GraphPad Prism 6.0。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對照組血漿中sCD93的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組血漿中sCD93蛋白水平為367.28±206.98 ng/ml，對照組為218.43±96.14 ng/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.803，P=0.000 3)。

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞因子的表達(dá)水平 見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞因子表達(dá)的比較

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組血漿中TNF-α，IL-4，IL-17和IFN-γ蛋白表達(dá)量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中TNF-α的表達(dá)量約為對照組的5倍，IFN-γ約為對照組的4倍，IL-4約為對照組的2倍。

2.3 實(shí)驗(yàn)組sCD93與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組ITP患者血漿中sCD93與TNF-α，IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.448,0.473；均P<0.05)；與IL-4，IFN-γ不具有相關(guān)性(r=0.198,0.245，均P>0.05)。

3 討論

ITP是一種基因異質(zhì)性的血液疾病，不同群體有不同的致病原因、發(fā)病史和療效[1，6]。兒童ITP患者常有近期感染史[7]，成人ITP則常伴有人類免疫缺陷病毒、幽門螺旋桿菌、丙肝病毒等慢性感染[1]。ITP疾病常常伴有Th1，Th2，Th17細(xì)胞亞群的失調(diào)和Tregs，Bregs細(xì)胞的免疫缺陷[1，2]。研究顯示ITP病人中，針對血小板自身抗原的T細(xì)胞分泌IL-2，IFN-γ增加，這表明CD4+T細(xì)胞群的分化趨向于Th1細(xì)胞亞群。此外，Th17細(xì)胞與IL-17產(chǎn)量也增加，表明Th17可能參與了ITP的免疫病理過程[2，7]。固有免疫中單核細(xì)胞被認(rèn)為是組織性巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的前身，在激活和極化自身免疫相關(guān)Th細(xì)胞方面有重要作用，實(shí)驗(yàn)表明去除CD16+單核細(xì)胞能升高Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞，抑制Th1細(xì)胞。在ITP中，CD16+單核細(xì)胞能促進(jìn)Th1細(xì)胞因子分泌，同時抑制Treg和Th17細(xì)胞[2]。而TLRs作為固有免疫反應(yīng)的哨兵，在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起到了重要作用。最近有研究表明，血小板的TLRs能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞抗原提成，在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起到了重要作用，這表明在ITP等血小板相關(guān)性疾病中TLRs信號通路亦扮演了重要角色[1]。

CD93是一種跨膜糖蛋白，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)包括C-型外源凝集素樣區(qū)域，系列EGF樣重復(fù)序列，高度糖基化黏蛋白樣區(qū)域，最近有研究表明CD93在調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞吞噬作用、維持組織穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)方面有重要作用[8]。研究表明CD93在上皮細(xì)胞的表達(dá)與血管重建相關(guān)，意味著其參與了血管重建過程，與急性炎癥、慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)[9，10]。在以THP-1為模型的細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CD93在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞之前能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生[4]。在試管試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TNF-α或LPS的刺激能導(dǎo)致CD93從單核細(xì)胞釋放成為sCD93，而sCD93能擴(kuò)大TLR介導(dǎo)的單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而提高單核細(xì)胞TLR通路的敏感度[5]，更有利于機(jī)體調(diào)動適應(yīng)性免疫過程[1]。基于CD93在免疫調(diào)節(jié)方面的作用，其在自身免疫如SSc，RA中亦備受關(guān)注，然而其在ITP中的作用機(jī)制尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)sCD93在ITP中上升，且與IL-17，TNF-α呈正相關(guān)，證明其可能參與了ITP的免疫性致病過程，但本實(shí)驗(yàn)樣本均來自同一地區(qū)，且樣本例數(shù)較少，有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。

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