MN血型基因分型應(yīng)用于河源地區(qū)臨床輸血檢測(cè)*

黃 璐，劉麗華，莊運(yùn)芳，陳麗紅，歐小懂，梁延連

(1.河源市中心血站，廣東河源 517000；2.深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

MNS血型系統(tǒng)是繼ABO血型系統(tǒng)之后第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，其復(fù)雜性僅次于Rh血型系統(tǒng)，迄今為止已發(fā)現(xiàn)47種抗原。在臨床輸血方面，MN血型具有重要意義，抗-M或抗-N抗體的存在可影響輸血前交叉配血，甚至引起溶血性輸血反應(yīng)或新生兒溶血病[1]。在歐洲、美洲等許多發(fā)達(dá)國(guó)家已將紅細(xì)胞MN血型鑒定作為臨床輸血的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目[2]。MN血型檢測(cè)有血清學(xué)方法和基因分型方法，有報(bào)道由于抗體的特異性，大量輸血患者或自身溶血性貧血患者檢測(cè)MN血型時(shí)，采用血清學(xué)方法得到的結(jié)果并不完全可靠[3]。本文應(yīng)用PCR-SSP基因分型技術(shù)鑒定因產(chǎn)生抗-M抗體影響交叉配血的患者樣本的MN血型，成功解決交叉配血問(wèn)題，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 本實(shí)驗(yàn)室收集交叉配血困難的患者標(biāo)本14例，經(jīng)譜細(xì)胞鑒定血漿中均存在抗-M抗體。

1.2 試劑 單克隆IgM性質(zhì)抗-M、抗-N血清及標(biāo)準(zhǔn)譜細(xì)胞試劑(上海血液生物醫(yī)藥公司)，抗人球蛋白試劑(美國(guó)Immucor公司)，DNA抽提試劑盒(美國(guó)QIAGEN公司)，PCR-SSP基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)公司)。

MN血型PCR-SSP基因分型試劑盒包括2種引物混合液：Mix-M與Mix-N，分別用于擴(kuò)增M，N血型基因片段，其特異性擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為162 bp和300 bp。試劑盒內(nèi)參質(zhì)控引物根據(jù)人類生長(zhǎng)激素基因(HGH)的保守片段設(shè)計(jì)，存在于每個(gè)引物中，且在每次試驗(yàn)中運(yùn)行，其特異性擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為865 bp。

1.3 儀器 KA-2200血清學(xué)離心機(jī)(日本KUBOTA公司)、Eppendorf高速離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)，Eppendorf9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Eppendorf公司)，Embitec電泳儀(美國(guó)Embitec公司)，D-77WWL-20M凝膠成像儀(美國(guó)Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 血型血清學(xué)鑒定：選取已知MN血型表現(xiàn)型血樣作陰、陽(yáng)對(duì)照，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行MN血型血清學(xué)鑒定；抗體篩查鑒定試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]方法。

1.4.2 PCR-SSP基因分型

1.4.2.1 DNA提取：吸取全血血樣300 μl，按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取樣本DNA。

1.4.2.2 PCR擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體系10 μl，其中引物混合液8 μl；Taq酶(1∶10稀釋)1 μl；模板DNA(濃度100 ng/L以上)1 μl。

1.4.2.3 PCR擴(kuò)增參數(shù)：采用熱啟動(dòng)技術(shù)，96℃2 min，96℃20 s，68℃60 s，5個(gè)循環(huán)；96℃20 s，65℃45 s，72℃30 s，10個(gè)循環(huán)；96℃20 s，62℃45 s，72℃30 s，15個(gè)循環(huán)；72℃3 min；降溫至4℃完成PCR擴(kuò)增。

1.4.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及結(jié)果分析：取擴(kuò)增產(chǎn)物各加1 μl熒光燃料后經(jīng)2 g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，每個(gè)PCR反應(yīng)都應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)度一致的865 bp內(nèi)對(duì)照產(chǎn)物，每孔均出現(xiàn)內(nèi)對(duì)照則認(rèn)為擴(kuò)增成功。根據(jù)試劑盒規(guī)定的M,N血型基因PCR產(chǎn)物位置判定對(duì)應(yīng)的基因型。

1.4.3 交叉配血：選擇M抗原陰性的血液與患者進(jìn)行鹽水法及間接抗人球法[4]交叉配血試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 樣本血清學(xué)與基因分型結(jié)果 見(jiàn)表1。14例樣本血清學(xué)鑒定結(jié)果與基因分型結(jié)果一致，其中11例為NN型，2例為MN型，1例為MM型。12～14號(hào)3例存在M抗原的患者樣本血漿中的抗-M抗體與自身的M抗原均不發(fā)生凝集反應(yīng)，而與異體的M抗原發(fā)生特異性凝集反應(yīng)。

表1 14例樣本MN血型檢測(cè)結(jié)果

2.2 基因分型結(jié)果 見(jiàn)圖1。

2.3 配型結(jié)果 選擇M抗原陰性的血液與該14例患者配血，鹽水介質(zhì)主、次側(cè)無(wú)溶血、無(wú)凝集，抗人球介質(zhì)主、次側(cè)無(wú)溶血、無(wú)凝集。患者輸血后無(wú)輸血反應(yīng)，24 h內(nèi)血紅蛋白上升。

(DNA Marker組成片段為：1 000，700，500，400，300，200，100bp。)

3 討論

MNS血型系統(tǒng)在臨床輸血、新生兒同種免疫性疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、干細(xì)胞移植等領(lǐng)域中起著重要作用。MN血型抗原在人出生時(shí)已發(fā)育成熟，據(jù)報(bào)道該血型系統(tǒng)抗原的功能涉及寄生蟲、細(xì)菌和病毒感染等[5]。MN血型抗原對(duì)應(yīng)的抗體都與輸血反應(yīng)有關(guān)，IgM抗-M可引起配血不合，M抗原陰性患者接受M抗原陽(yáng)性血液，可能產(chǎn)生潛在不良反應(yīng)。如果患者處于低溫麻醉狀態(tài)下手術(shù)時(shí)應(yīng)注意，因?yàn)榇祟惪贵w可激活補(bǔ)體，當(dāng)患者的體溫在冷抗體最適反應(yīng)溫度范圍內(nèi)(4℃～20℃)時(shí)，可發(fā)生溶血反應(yīng)。免疫性IgG抗-M可引起新生兒溶血病和溶血性輸血反應(yīng)。據(jù)上海等地大量篩查數(shù)據(jù)顯示臨床申請(qǐng)輸血的患者抗-M抗體的檢出率為0.73‰～1.23‰[6～8]，是繼Rh血型系統(tǒng)抗體以外檢出率最高的一種抗體。筆者前期調(diào)查顯示河源地區(qū)MN血型的M和N基因頻率分別為0.562 5和0.43 75，當(dāng)?shù)厝巳号R床隨機(jī)輸血MN血型抗原不配合概率高達(dá)0.37 11[9]。臨床輸血中血型抗體的產(chǎn)生與相應(yīng)抗原免疫原性的強(qiáng)弱及抗原不配合概率的高低密切相關(guān)，理論上，抗原不配合概率越高，輸血次數(shù)越多，其潛在產(chǎn)生抗體的機(jī)會(huì)也越高，為保障輸血安全，應(yīng)考慮逐步將紅細(xì)胞MN血型鑒定作為臨床輸血的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

MN血型系統(tǒng)的檢測(cè)方法大多用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，PCR技術(shù)也逐步用于MN血型系統(tǒng)的檢測(cè)。血清學(xué)方法快速、經(jīng)濟(jì)、不受實(shí)驗(yàn)室條件等限制，可操作性強(qiáng)。但在大量輸血、自身免疫性溶血性貧血等患者檢測(cè)MN血型時(shí)，結(jié)果常難以確認(rèn)，存在一定局限性。PCR-SSP基因分型法能直接確定基因型，所需樣本量小，取材更廣泛。但所需耗時(shí)長(zhǎng)，需要配套的儀器，使其應(yīng)用受到一定限制。上述兩種方法均有一定的優(yōu)勢(shì)和局限性。筆者采用PCR-SSP基因分型及血清學(xué)方法同時(shí)對(duì)14例因產(chǎn)生抗-M抗體而影響交叉配血的患者樣本進(jìn)行MN血型鑒定，結(jié)果14例樣本血清學(xué)鑒定結(jié)果與基因分型結(jié)果均一致。值得注意的是本文所選14例產(chǎn)生抗-M的樣本中，有2例為MN型，1例為MM型，這3例血漿中的抗-M抗體均不與自身紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，而與異體的M抗原發(fā)生特異性凝集反應(yīng)。通常情況下，紅細(xì)胞表面存在相關(guān)的抗原，則血漿中不應(yīng)存在該抗原對(duì)應(yīng)的抗體。對(duì)于紅細(xì)胞上既有M抗原又產(chǎn)生相應(yīng)抗-M抗體的現(xiàn)象，有研究[10]表明人類紅細(xì)胞MNS血型中抗-M的產(chǎn)生與M抗原是否存在沒(méi)有必然關(guān)聯(lián)，與相關(guān)基因GYPA的表達(dá)也無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。抗-M抗體除了由輸血、妊娠等免疫產(chǎn)生以外，還可以由自然界的類M物質(zhì)或細(xì)菌感染所致，特別對(duì)于燒傷患者或兒童更為常見(jiàn)。此外，亦有報(bào)道提出這類抗體的產(chǎn)生是否與M或N的亞型分型相關(guān)的疑問(wèn)[11]。

臨床上出現(xiàn)的抗-M抗體可以以不同性質(zhì)出現(xiàn)，可以是IgM性質(zhì)也可以是IgG性質(zhì)，但只要患者的血漿中檢出抗-M，如果需要輸血，都應(yīng)輸注M抗原陰性的紅細(xì)胞。

本文檢測(cè)結(jié)果顯示PCR-SSP基因分型方法與血清學(xué)方法可實(shí)現(xiàn)相互驗(yàn)證，基因分型方法可作為血清學(xué)方法的補(bǔ)充。

致謝：本課題得到深圳市血液中心盧亮?xí)洝⒘貉舆B教授、蘇宇清教授的技術(shù)支持與幫助，在此一并表示感謝！

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