MN血型基因分型應用于河源地區(qū)臨床輸血檢測*

黃 璐，劉麗華，莊運芳，陳麗紅，歐小懂，梁延連

(1.河源市中心血站，廣東河源 517000；2.深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

MNS血型系統(tǒng)是繼ABO血型系統(tǒng)之后第二個被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，其復雜性僅次于Rh血型系統(tǒng)，迄今為止已發(fā)現(xiàn)47種抗原。在臨床輸血方面，MN血型具有重要意義，抗-M或抗-N抗體的存在可影響輸血前交叉配血，甚至引起溶血性輸血反應或新生兒溶血病[1]。在歐洲、美洲等許多發(fā)達國家已將紅細胞MN血型鑒定作為臨床輸血的常規(guī)檢測項目[2]。MN血型檢測有血清學方法和基因分型方法，有報道由于抗體的特異性，大量輸血患者或自身溶血性貧血患者檢測MN血型時，采用血清學方法得到的結果并不完全可靠[3]。本文應用PCR-SSP基因分型技術鑒定因產生抗-M抗體影響交叉配血的患者樣本的MN血型，成功解決交叉配血問題，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 本實驗室收集交叉配血困難的患者標本14例，經譜細胞鑒定血漿中均存在抗-M抗體。

1.2 試劑 單克隆IgM性質抗-M、抗-N血清及標準譜細胞試劑(上海血液生物醫(yī)藥公司)，抗人球蛋白試劑(美國Immucor公司)，DNA抽提試劑盒(美國QIAGEN公司)，PCR-SSP基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術公司)。

MN血型PCR-SSP基因分型試劑盒包括2種引物混合液：Mix-M與Mix-N，分別用于擴增M，N血型基因片段，其特異性擴增產物長度分別為162 bp和300 bp。試劑盒內參質控引物根據人類生長激素基因(HGH)的保守片段設計，存在于每個引物中，且在每次試驗中運行，其特異性擴增產物長度為865 bp。

1.3 儀器 KA-2200血清學離心機(日本KUBOTA公司)、Eppendorf高速離心機(美國Eppendorf公司)，Eppendorf9700PCR擴增儀(美國Eppendorf公司)，Embitec電泳儀(美國Embitec公司)，D-77WWL-20M凝膠成像儀(美國Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 血型血清學鑒定：選取已知MN血型表現(xiàn)型血樣作陰、陽對照，嚴格按照試劑說明書進行MN血型血清學鑒定；抗體篩查鑒定試驗參照文獻[4]方法。

1.4.2 PCR-SSP基因分型

1.4.2.1 DNA提取：吸取全血血樣300 μl，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA。

1.4.2.2 PCR擴增體系：總反應體系10 μl，其中引物混合液8 μl；Taq酶(1∶10稀釋)1 μl；模板DNA(濃度100 ng/L以上)1 μl。

1.4.2.3 PCR擴增參數：采用熱啟動技術，96℃2 min，96℃20 s，68℃60 s，5個循環(huán)；96℃20 s，65℃45 s，72℃30 s，10個循環(huán)；96℃20 s，62℃45 s，72℃30 s，15個循環(huán)；72℃3 min；降溫至4℃完成PCR擴增。

1.4.2.4 擴增產物電泳及結果分析：取擴增產物各加1 μl熒光燃料后經2 g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，每個PCR反應都應產生強度一致的865 bp內對照產物，每孔均出現(xiàn)內對照則認為擴增成功。根據試劑盒規(guī)定的M,N血型基因PCR產物位置判定對應的基因型。

1.4.3 交叉配血：選擇M抗原陰性的血液與患者進行鹽水法及間接抗人球法[4]交叉配血試驗。

2 結果

2.1 樣本血清學與基因分型結果 見表1。14例樣本血清學鑒定結果與基因分型結果一致，其中11例為NN型，2例為MN型，1例為MM型。12～14號3例存在M抗原的患者樣本血漿中的抗-M抗體與自身的M抗原均不發(fā)生凝集反應，而與異體的M抗原發(fā)生特異性凝集反應。

表1 14例樣本MN血型檢測結果

2.2 基因分型結果 見圖1。

2.3 配型結果 選擇M抗原陰性的血液與該14例患者配血，鹽水介質主、次側無溶血、無凝集，抗人球介質主、次側無溶血、無凝集。患者輸血后無輸血反應，24 h內血紅蛋白上升。

(DNA Marker組成片段為：1 000，700，500，400，300，200，100bp。)

3 討論

MNS血型系統(tǒng)在臨床輸血、新生兒同種免疫性疾病診斷、法醫(yī)學、遺傳學、干細胞移植等領域中起著重要作用。MN血型抗原在人出生時已發(fā)育成熟，據報道該血型系統(tǒng)抗原的功能涉及寄生蟲、細菌和病毒感染等[5]。MN血型抗原對應的抗體都與輸血反應有關，IgM抗-M可引起配血不合，M抗原陰性患者接受M抗原陽性血液，可能產生潛在不良反應。如果患者處于低溫麻醉狀態(tài)下手術時應注意，因為此類抗體可激活補體，當患者的體溫在冷抗體最適反應溫度范圍內(4℃～20℃)時，可發(fā)生溶血反應。免疫性IgG抗-M可引起新生兒溶血病和溶血性輸血反應。據上海等地大量篩查數據顯示臨床申請輸血的患者抗-M抗體的檢出率為0.73‰～1.23‰[6～8]，是繼Rh血型系統(tǒng)抗體以外檢出率最高的一種抗體。筆者前期調查顯示河源地區(qū)MN血型的M和N基因頻率分別為0.562 5和0.43 75，當地人群臨床隨機輸血MN血型抗原不配合概率高達0.37 11[9]。臨床輸血中血型抗體的產生與相應抗原免疫原性的強弱及抗原不配合概率的高低密切相關，理論上，抗原不配合概率越高，輸血次數越多，其潛在產生抗體的機會也越高，為保障輸血安全，應考慮逐步將紅細胞MN血型鑒定作為臨床輸血的常規(guī)檢測項目。

MN血型系統(tǒng)的檢測方法大多用傳統(tǒng)的血清學方法，PCR技術也逐步用于MN血型系統(tǒng)的檢測。血清學方法快速、經濟、不受實驗室條件等限制，可操作性強。但在大量輸血、自身免疫性溶血性貧血等患者檢測MN血型時，結果常難以確認，存在一定局限性。PCR-SSP基因分型法能直接確定基因型，所需樣本量小，取材更廣泛。但所需耗時長，需要配套的儀器，使其應用受到一定限制。上述兩種方法均有一定的優(yōu)勢和局限性。筆者采用PCR-SSP基因分型及血清學方法同時對14例因產生抗-M抗體而影響交叉配血的患者樣本進行MN血型鑒定，結果14例樣本血清學鑒定結果與基因分型結果均一致。值得注意的是本文所選14例產生抗-M的樣本中，有2例為MN型，1例為MM型，這3例血漿中的抗-M抗體均不與自身紅細胞發(fā)生凝集反應，而與異體的M抗原發(fā)生特異性凝集反應。通常情況下，紅細胞表面存在相關的抗原，則血漿中不應存在該抗原對應的抗體。對于紅細胞上既有M抗原又產生相應抗-M抗體的現(xiàn)象，有研究[10]表明人類紅細胞MNS血型中抗-M的產生與M抗原是否存在沒有必然關聯(lián)，與相關基因GYPA的表達也無明顯關聯(lián)。抗-M抗體除了由輸血、妊娠等免疫產生以外，還可以由自然界的類M物質或細菌感染所致，特別對于燒傷患者或兒童更為常見。此外，亦有報道提出這類抗體的產生是否與M或N的亞型分型相關的疑問[11]。

臨床上出現(xiàn)的抗-M抗體可以以不同性質出現(xiàn)，可以是IgM性質也可以是IgG性質，但只要患者的血漿中檢出抗-M，如果需要輸血，都應輸注M抗原陰性的紅細胞。

本文檢測結果顯示PCR-SSP基因分型方法與血清學方法可實現(xiàn)相互驗證，基因分型方法可作為血清學方法的補充。

致謝：本課題得到深圳市血液中心盧亮書記、梁延連教授、蘇宇清教授的技術支持與幫助，在此一并表示感謝！

[1] 杰夫·丹尼爾(英)．人類血型[M]．2版.朱自嚴，譯．北京：科學出版社，2007：172．

Daniels G．Human Blood Groups[M]．Second edition．Zhu ZY，Translation．Beijing：Science Press，2007：172．

[2] Lee E，Burgess G，Halverson GR，et al．Applications of murine and humanized chimaeric monoclonal antibodies for red cell phenotyping[J]．Br J Haematol，2004，126(2)：277-281．

[3] 許德意，孫春霞，高家良，等．MN血型四種方法檢測比較分析[J]．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23(8)：37-39．

Xu DY，Sun CX，Gao JL，et al．Comparative analysis of four kinds of methods to detect the MN blood group[J]．Chinese Journal of Birth Health & Heredity，2015，23(8)：37-39．

[4] 葉應嫵，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規(guī)程[S]．3版．南京：東南大學出版社，2006：260-261．

Ye YW，Wang YS，Shen ZY．National Guide to Clinical Laboratory Procedures[S]．Third Edition．Nanjing：Southeast University Press，2006：260-261．

[5] Reid ME．MNS blood group system：a review[J]．Immunohematology，2009，25(3)：95-101．

[6] 王鈺箐，蔡曉紅，龔淞頌，等．46 346名患者不規(guī)則抗體篩查結果及分析[J]．中國輸血雜志，2015，28(8)：1004-1006．

Wang YQ，Cai XH，Gong SS，et al．Result analysis of irregular antibody screening[J]．Chin J Blood Transfusion，2015，28(8)：1004-1006．

[7] 李 惠，徐煥銘，張 毅，等．輸血前患者不規(guī)則抗體篩查及鑒定結果分析[J]．中國實驗血液學雜志，2015，23(3)：861-865．

Li H，Xu HM，Zhang Y，et al．Analysis of patients` irregular antibody screening and identification results before blood transfusion[J]．Journal of Experimental Hematology，2015，23(3)：861-865．

[8] 王曉華，樊 晶．備血患者不規(guī)則抗體篩查及其結果分析[J]．中國輸血雜志，2015，28(12)：1513-1515．

Wang XH，F(xiàn)an J．Analysis of irregular antibody scre-ening results in patients prepared for blood transfusion[J]．Chin J Blood Transfusion，2015，28(12)：1513-1515．

[9] 黃 璐，陳麗紅，莊運芳，等．廣東省河源地區(qū)MN血型基因頻率調查[J]．國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2014，20(14)：2052-2054．

Huang L，Chen LH，Zhuang YF，et al．Gene frequencies of MN blood group in Heyuan，Guangdong[J]．International Medicine and Health Guidance News，2014，20(14)：2052-2054．

[10] 陳云龍，梁延連，蘇宇清，等．人類紅細胞MN血型中抗-M與GYPA基因表達的相關性[J]．臨床輸血與檢驗，2014，16(1)：8-10．

Chen YL，Liang YL，Su YQ，et al．A study of correlation of anti-M production and the GYPA expression in human MN blood type[J]．J Clin Transfus Lab Med，2014，16(1)：8-10．

[11] 梁延連，蘇宇清，吳 凡，等．中國人群MN血型中M，N等位基因多態(tài)性的研究[J]．中國實驗血液學雜志，2015，23(2)：537-540．

Liang YL，Su YQ，Wu F，et al．Polymorphism of M，N allele in MN blood group of Chinese population[J]．Journal of Experimental Hematology，2015，23(2)：537-540．