氣道上皮細胞衍生的胰島素樣生長因子觸發(fā)偏移CD8+T細胞極化

黃邵洪，李　昀，覃　杰，安　軍，張軍航，榮　健

(中山大學附屬第三醫(yī)院1.胸心外科、2.放射科，廣東 廣州　510630；3.中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東，廣州　510089)

氣道上皮細胞衍生的胰島素樣生長因子觸發(fā)偏移CD8+T細胞極化

黃邵洪1，李昀1，覃杰2，安軍1，張軍航1，榮健3

(中山大學附屬第三醫(yī)院1.胸心外科、2.放射科，廣東 廣州510630；3.中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東，廣州510089)

中國圖書分類號：R322.35；R329.25；R392.12；R977.6

摘要:目的探討氣道上皮細胞衍生的胰島素樣生長因子(IGF1)對CD8+T細胞極化的影響。方法人氣道上皮細胞株RPMI2650與鼠過敏原Der p1共培養(yǎng)72 h，用定量PCR及Western免疫印跡檢測其IGF1表達情況。將前述上皮細胞、重組IGF1和IGF1抗體分別加入抗體激活的CD8+T細胞中培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。檢測Der p1活化的上皮細胞及IGF1對CD8+T細胞p53基因甲基化及表達的影響。結(jié)果加入Der p1共同孵育后，RPMI2650細胞IGF1mRNA(23.1%±5.2% vs 5.2%±2.3%，P<0.01)和蛋白表達(33.4±6.4 vs 9.2±4.6，P<0.01)均明顯增加。將CD3/CD28抗體激活的CD8+T細胞與Der p1活化的上皮細胞共培養(yǎng)，凋亡細胞增加的趨勢被抑制(41.7%±8.2% vs 5.2%±1.8%，P<0.01)。直接加入重組IGF1有同樣效果，而IGF1抗體能阻斷該效應。Der p1活化的上皮細胞能抑制活化CD8+T細胞p53基因mRNA(29.1%±5.9% vs 16.2%±4.3%，P<0.01)和蛋白表達(63.3±8.9 vs 26.9±5.6，P<0.01)，加入IGF1抗體后這種作用消失。重組IGF1使CD8+T細胞p53基因甲基化增加。結(jié)論Der p1蛋白能夠誘發(fā)RPMI2650細胞產(chǎn)生IGF1，后者通過誘導p53基因甲基化抑制CD8+T細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:氣道上皮細胞；胰島素樣生長因子；p53基因；甲基化；CD8+T細胞；凋亡

偏移的CD8+T細胞極化在許多免疫異常反應中起重要作用，比如風濕性關(guān)節(jié)炎[1]、糖尿病[2]和顱內(nèi)感染[3]。在哮喘發(fā)生中，CD8+T細胞極化同樣起重要作用，但何種原因?qū)е缕錁O化并不清楚[4]。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF1)又稱為生長調(diào)節(jié)素C(somatomedin C)，促進生長和防止細胞死亡。IGF1在人的一生中都發(fā)揮作用，尤其是在兒童期和青春期。IGF1主要由肝臟產(chǎn)生，通常是生長激素啟動的后續(xù)信號。IGF1也是一些過敏性疾病(如哮喘)的發(fā)病因素之一。嗜堿性粒細胞表達IGF1受體，當暴露于IGF1后，前者被激活并釋放胞內(nèi)顆粒[5]。小鼠氣道過敏模型中檢出IGF1高表達[6]，還有學者認為IGF1對未成熟的肺成纖維細胞有促進α平滑肌表達和膠原蛋白合成的作用，這將導致肺纖維化(由核因子κB轉(zhuǎn)錄介導)[7]。除肝臟外，IGF1還可由氣道炎癥細胞產(chǎn)生，但具體是何種類型細胞尚不清楚[8]。

被激活后T細胞通過凋亡進入激活誘導的細胞死亡(activation-induced cell death, AICD)，維持機體免疫平衡。作為死亡信號受體的Fas基因及其配體FasL，在T細胞被激活后表達上調(diào)，F(xiàn)as/FasL相互作用下啟動細胞凋亡[9]。除了Fas/FasL通路外，還有其他分子在凋亡啟動中發(fā)揮作用，如p53蛋白。盡管p53蛋白主要是誘導腫瘤細胞凋亡，其他細胞中也有表達，氮芥誘導的小鼠皮膚細胞凋亡和炎癥反應，這一過程就是依賴p53基因表達的[10]。紫外線照射誘導人角質(zhì)細胞調(diào)節(jié)ERK1/2和血栓調(diào)節(jié)素表達就是由p53基因介導的[11]。然而，p53基因在CD8+T細胞AICD過程，尤其是偏移CD8+T細胞極化中的作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，過敏性刺激使小鼠氣道上皮細胞表達IGF1，這種上皮細胞產(chǎn)生的IGF1抑制CD8+T細胞p53表達，參與抗原特異性的CD8+T細胞極化過程。

1材料與方法

1.1試劑IGF1及p53抗體購自Santa Cruz Biotech上海分公司；定量qRT-PCR及Western免疫印跡試劑購自Invitrogen上海分公司；Der p1蛋白購自MyBiosource公司(San Diego, CA)；顆粒酶B及穿孔素ELISA套件購自R&D Systems上海分公司；膜聯(lián)蛋白Annexin V套件購自Sigma Aldrich上海分公司；免疫細胞分離提取套件購自Miltenyi Biotech上海分公司；DNA純化套件購自Promega北京分公司；EpiXploreTM甲基化檢測套件購自Clontech北京分公司。

1.2細胞培養(yǎng)人鼻腔上皮細胞株RPMI2650購自美國細胞培養(yǎng)協(xié)會(American Type Culture Collection，ATCC, Manassas, VA, USA)，置于DMEM細胞培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)，加入10%小牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素及200 mmol·L-1谷氨酸。培養(yǎng)箱條件為37℃恒溫，含5% CO2。

1.3定量實時PCR(qRT-PCR)細胞總RNA通過TRIzol reagents試劑盒提取。cDNA由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。qRT-PCR由MiniOpticon實時PCR系統(tǒng)(Bio-Rad Life Science公司, 上海)完成。研究所用引物為：IGF1 (NCBI: NM_001111283), 正向:3′-TCTGAATCTTGGCTGCTGGA-5′，反向: 3′-TGTGCTTCTTGACGACTTGC-5′；p53 (NCBI: AB082923), 正向:3′-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-5′，反向: 3′-GGTACAGTCAGAGCCAACCT-5′。結(jié)果用內(nèi)參β-actin相對量表達。

1.4Western免疫印跡細胞總蛋白提取后由SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶孵育封閉后加入一抗(100~500 μg·L-1)，室溫下孵育1 h后，加入辣根過氧化物酶結(jié)合二抗繼續(xù)孵育1 h。每次孵育完成后，用緩沖液(Triton X-100)沖洗多余抗體。免疫反應結(jié)束后生成化學發(fā)光底物，并由X射線膠片成像。膠片成像后由系統(tǒng)自帶圖像軟件量化免疫印跡密度。

1.5流式細胞計數(shù)細胞經(jīng)熒光標記的一抗染色后由流式細胞計數(shù)儀(FACSCanto II，BD Bioscience，上海分公司)計數(shù)。凋亡細胞通過Annexin V套件染色后檢測。死亡細胞由碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 mg·L-1, 15 min染色后檢測計數(shù)。

1.6CD8+T細胞純化由健康志愿者獲得外周血標本(每人20 mL)，實驗及血樣采集經(jīng)我院倫理委員會批準。經(jīng)梯度離心獲得外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。通過免疫磁珠細胞分離套件將PBMC中CD8+T細胞及CD11c+樹突狀細胞(dendritic cells，DC)分離，并經(jīng)流式細胞儀檢測，CD8+CD25-T細胞及DC純度均超過98%。

1.7抗原特異性CD8+T細胞多克隆增殖的評估將CD8+CD25-T細胞用琥珀酰亞胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE)標記，置于2 mg·L-1CD3抗體和5 mg·L-1CD28抗體包被環(huán)境下培養(yǎng)72 h。T細胞增殖率通過CFSE稀釋法測定。

1.8抗原特異性CD8+T細胞激活的評估將CD8+CD25-T細胞置于Transwell底層小室中培養(yǎng)，間隔層為RPMI2650細胞株。Der p1蛋白(鹽水作為對照或加入抗IGF1中和抗體200 μg·L-1)置于頂層小室，濃度為30 μg·L-1，孵育72 h。收獲CD8+T細胞并用CFSE標記，加入DC細胞(T細胞 ∶DC=5 ∶1)，在30 μg·L-1Der p1蛋白或小牛血清蛋白中培養(yǎng)72 h。CD8+T細胞增殖率通過CFSE稀釋法測定。培養(yǎng)液中顆粒酶B及穿孔素水平由相應ELISA試劑盒檢測。

1.951鉻(51Cr)釋放檢測激活的CD8+T細胞用51Cr釋放檢測法分析。以結(jié)腸癌細胞株T84作為靶細胞，用51Cr標記孵育2 h。沖洗后將T84細胞(108·L-1)和CD8+T細胞(108·L-1)置于Transwell底層小室中。間隔層為RPMI2650細胞(109·L-1)。底層小室上清液每4 h收集一次75 μL。51Cr活性由γ射線計數(shù)器(Perkin Elmer公司，美國)測定，最大釋放量和自發(fā)釋放量分別通過加入2% Triton X-100和培養(yǎng)液獲得。CD8+T細胞激活產(chǎn)生的51Cr特異性釋放量由以下公式計算：(A-B)/(C-B)×100%，A：實際測定量，B：自發(fā)釋放量，C：最大釋放量。

1.10p53基因甲基化測定將純化的DNA用EpiXploreTM甲基化檢測套件進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，進行甲基化測定。p53基因的引物序列分別為：(1)甲基化引物，正向:3′-ATTTTAGTGGTAATTTATTGGGACG-5′，反向: 3′-TAATAAAACTCCCCTTTCTTACGAA-5′；(2)非甲基化引物，正向:3′-TTTTAGTGGTAATTTATTGGGATGG-5′，反向: 3′-TAATAAAACTCCCCTTTCTTACAAA-5′。

2結(jié)果

2.1Der p1蛋白誘導氣道上皮細胞生成IGF1氣道上皮細胞能夠產(chǎn)生IGF1[12]，但其觸發(fā)生成的誘因尚未明確。我們同時檢測了IGF1在人氣道上皮細胞(RPMI2650細胞)基線水平的mRNA(Fig 1A)和蛋白(Fig 1B-C)水平的表達量，二者在暴露于Der p1后均明顯增加，并且這種增加具有劑量依賴性(Fig 1)。該結(jié)果提示：鼠致敏原能上調(diào)人氣道上皮細胞IGF1表達。

Human airway epithelial cell line RPMI2650 cells, was cultured in the presence or absence of a mite allergen, Der p1, for 72 h. A: The bars indicate the levels of IGF1 mRNA; B: The immune blots indicate the IGF1 protein levels. The bars below the blots indicate the summarized integrated density of the blots. BSA is an irrelevant control protein (50 μg·L-1); C: The bars indicate the cell counts from day 0 to day 3.**P<0.01vsBSA group (A, B), or day 0 group (C).

2.2氣道上皮細胞生成的IGF1抑制CD8+T細胞AICD盡管偏移CD8+T細胞極化在氣道過敏性疾病發(fā)生中起作用[13]，但上皮細胞表達的IGF1是否對CD8+T細胞極化有作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，原始CD8+T細胞能夠被CD3/CD28抗體激活，表現(xiàn)為CD8+T細胞增殖(Fig 2A)，同時激活的CD8+T細胞中存在大量凋亡細胞(Fig 2B-C)。在混合培養(yǎng)液中，鹽水對照組中凋亡CD8+T細胞處于低水平(Fig 2B、2Ca)，加入CD3/CD28抗體激活后凋亡CD8+T細胞明顯增加(Fig 2B、2Cb)。加入Der p1孵育的上皮細胞后，凋亡細胞增加的趨勢被抑制(Fig 2B、2Cc)，而加入未經(jīng)處理的上皮細胞則無此效果(Fig 2B、2Cd)。該結(jié)果提示，氣道上皮細胞生成的IGF1會抑制CD8+T細胞AICD過程。為進一步證實該想法，我們在上述實驗中加入IGF1抗體，發(fā)現(xiàn)Der p1孵育上皮細胞對CD8+T細胞凋亡抑制作用被阻斷了(Fig 2B、2Ce、2Cf)，加入重組IGF1進一步證實了該結(jié)果(Fig 2B、2Cg)。

2.3氣道上皮細胞生成的IGF1通過MEK-ERK通路誘導CD8+T細胞p53基因甲基化p53基因產(chǎn)物能夠誘導細胞凋亡，由此我們進一步確定IGF1是否通過該途徑抑制CD8+T細胞AICD[14]。我們利用實驗Fig 2中部分細胞，檢測其生成的IGF1能否調(diào)節(jié)CD8+T細胞p53蛋白表達。定量PCR和Western免疫印跡均顯示CD8+T細胞p53蛋白表達。以CD3/CD28抗體激活后，CD8+T細胞p53蛋白表達明顯增加， Der p1孵育的RPMI2650細胞能抑制該趨勢，而加入IGF1抗體后這種作用消失(Fig 3A-B)。由此可見，激活CD8+T細胞將使p53蛋白表達增加，而上皮細胞生成的IGF1則可以阻斷該過程。

為闡明IGF1抑制CD8+T細胞p53表達的機制，我們進行了甲基化特異性PCR檢測。結(jié)果顯示，在原始CD8+T細胞中，p53基因存在部分甲基化，而在暴露于重組IGF1后，這一比例明顯增加。在MEK-ERK缺乏CD8+T細胞中則未觀察到該現(xiàn)象(Fig 3C)。Western免疫印跡顯示，IGF1處理后的CD8+T細胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平并無明顯變化(Fig 3D-E)。

2.4Der p1蛋白誘導的氣道上皮細胞激活的CD8+T細胞具有Der p1特異性免疫反應氣道上皮細胞表達MHC I和MHC II[15]及B7分子，并將抗原呈遞給T細胞[14]。為了明確氣道上皮細胞生成的IGF1能否作為抗原特異性偏移CD8+T細胞極化的啟動因子，我們將原始CD8+T細胞和Der p1蛋白誘導的氣道上皮細胞共同孵育48 h。將獲得的CD8+T細胞置于特異性抗原Der p1環(huán)境下，加入新鮮提取的DC共孵育72 h。特異性CD8+T細胞出現(xiàn)明顯增殖，加入IGF1中和抗體后增殖被抑制(Fig 4A)。

Fig 2　Epithelial cell-derived IGF1 reduces AICD of CD8+ T cells

A: The histograms indicate the proliferation of CD8+T cells; B: The bars indicate the frequency of dead CD8+T cells and apoptotic CD8+T cells in the activated CD8+T cells; C: The dot plots indicate the frequencies of PI+or/and Annexin V+CD8+T cells.**P<0.01vsgroup a.

Na?ve CD8+T cells were treated in the same procedures of Fig 2C, the bars (A) and immune blots (B) indicate the levels of p53 in CD8+T cells.**P<0.01vsgroup a. C：The p53 gene methylation results. M: Methylated； U: Un-methylated； rIGF1: Recombinant IGF1； U0126: The MEK-ERK inhibitor; LY294002:The PIK3-Akt inhibitor. BSA is an irrelevant protein using as a control; Anti-CD3/CD28: CD8+T cells were treated with anti-CD3/CD28 antibodies. D and E: The immune blots indicate the protein contents of Bcl-2 (D) and Bcl-xL (E) in the CD8+T cell extracts.

培養(yǎng)液中細胞毒因子、顆粒酶B(Fig 4B)及穿孔素(Fig 4C)水平明顯升高。該結(jié)果提示，氣道上皮細胞生成的IGF1能夠觸發(fā)抗原特異性CD8+T細胞極化。CD8+T細胞的激活通過特異性溶解反應得到證實(Fig 4D)。

3討論

Fig 4　Epithelial cell-derived IGF1 induces CD8+ T cell polarization

A~F：The histograms indicate the frequency of CD8+T cell proliferation; A~B: Without the presence of epithelial cells; C~E: In the presence of epithelial cells; F: Staining controls; G~I: The bars indicate the levels of granzyme B (G), perforin (H) and specific lysis (I). The labels of x axis are the same as the labels of histograms.**P<0.01vsgroup A.

許多免疫系統(tǒng)異常或多或少都與偏移CD8+T細胞極化相關(guān)。本研究顯示氣道上皮細胞(RPMI2650細胞)，能夠在鼠過敏原Der p1蛋白作用下產(chǎn)生IGF1。而這種氣道上皮細胞生成的IGF1將使p53基因發(fā)生甲基化，進而抑制CD8+T細胞的凋亡進程，促成CD8+T細胞極化。

鼠過敏原在許多過敏性疾病發(fā)生過程中扮演重要角色。除了作為通常意義下的過敏原外，它們中的一些亞型(如Der p1)具有蛋白酶樣作用，能夠影響上皮細胞緊密連接處的完整性，并且能夠激活蛋白酶活化受體2，從而破壞上皮屏障功能[16]。我們的研究提供了進一步證據(jù)：Der p1能夠誘導RPMI2650細胞生成IGF1。IGF1通常是由肝細胞生成的，但其他細胞(如氣道組織中的炎癥細胞)也可以產(chǎn)生[8]。

AICD是一種T細胞的正常激活反應。這種過程在T細胞被激活后就啟動并誘導凋亡，AICD在維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定中意義重大。AICD是由Fas受體(Fas，CD95)和Fas配體(FasL，CD95 ligand)相互作用下誘導的細胞凋亡。機體許多(免疫耐受)重要器官，如睪丸、大腦、角膜等，其細胞均有FasL高表達,用以抑制免疫反應對這些器官可能造成的損傷。這就不難理解如果AICD機制出現(xiàn)異常，會發(fā)生多種自身免疫疾病。本研究顯示，被CD3/CD28抗體激活后凋亡CD8+T細胞明顯增加，而氣道上皮細胞生成的IGF1使凋亡和死亡細胞數(shù)減少。加入IGF1中和抗體后，減少CD8+T細胞凋亡的作用被抑制，再加入重組IGF1又可恢復這種抑制作用。其他學者也發(fā)現(xiàn)IGF1能夠抑制細胞凋亡[17-18]。

p53基因作用缺失會造成許多疾病。p53蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，在許多腫瘤中存在變異[19]。p53蛋白還在其他疾病中起作用，諸如缺血性細胞損傷[20]、吸煙相關(guān)性疾病[21]。我們發(fā)現(xiàn)p53蛋白在氣道上皮細胞生成的IGF1誘導抑制CD8+T細胞AICD過程中有作用。IGF1能夠通過MEK-ERK通路誘發(fā)p53基因甲基化。其他學者證實在間質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化時，IGF1同樣通過MEK-ERK通路促進這一進程[22]。

總之，鼠過敏原Der p1蛋白能夠誘發(fā)氣道上皮細胞——RPMI2650細胞產(chǎn)生IGF1，后者通過誘導p53基因甲基化抑制CD8+T細胞AICD。

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網(wǎng)絡出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.012.html

Airway epithelial cell-derived insulin-like growth factor-1

triggers skewed CD8+T cell polarization

HUANG Shao-hong1, LI Yun1,QIN Jie2, AN Jun1, ZHANG Jun-hang1, RONG Jian3

(1.DeptofThoracocardiacSurgery, 2.DeptofRadiology,theThirdAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou

510630,China; 3.DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou510089,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of airway epithelial cell-derived insulin-like growth factor-1(IGF1) on CD8+T cell polarization. MethodsHuman airway epithelial cell line, RPMI2650 cells, was cultured in the presence of a mice allergen, Der p1, for 72 h. IGF1 expression was checked with quantitative RT-PCR and Western blot. Der p1-primed RPMI2650 cells, recombinant IGF1 and anti-IGF1 antibody was cocultured respectively with CD8+T cells, which were activated by anti-CD3/CD8 Ab. Apoptotic cells frequency was calculated with flow cytometry. The alteration of p53 gene hypermethylation in CD8+T cells elicited by Der p1-primed airway epithelial cell and IGF1 was plotted. ResultsBoth mRNA(23.1%±5.2% vs 5.2%±2.3%，P<0.01)and protein(33.4±6.4 vs 9.2±4.6，P<0.01)expression of IGF1 in RPMI2650 cells markedly increased after exposure to Der p1. The increase of apoptotic CD3/CD28 Ab-activated CD8+T cells was abolished by the presence of Derp1-primed epithelial cells(41.7%±8.2% vs 5.2%±1.8%，P<0.01). The results were con-firmedbytheadditionofrecombinantIGF1.Anti-IGF1 antibody abolished the effect of the epithelial cells. Derp1-primed epithelial cells inhibited p53 gene mRNA(29.1%±5.9% vs 16.2%±4.3%，P<0.01)and protein(63.3±8.9 vs 26.9±5.6，P<0.01)expression. Anti-IGF1 antibody abolished the effect. Recombinant IGF1 promoted CD8+T cells′ p53 gene hypermethylation. ConclusionDer p1 induces RPMI2650 cells to produce IGF1, and this factor prevents CD8+T cell apoptosis by inducing p53 gene hypermethylation.

Key words:airway epithelial cell; insulin-like growth factor-1; p53 gene; hypermethylation; CD8+T cell; apoptosis

通訊作者榮健(1971-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：體外循環(huán)及惡性腫瘤臨床與基礎(chǔ)，，E-mail：jiji126@126.com

作者簡介：黃邵洪(1976-)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌及食管腫瘤臨床與基礎(chǔ)，E-mail：legendhuang@126.com;

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81371714)；廣東省自然科學基金資助項目(No S2012010008151)

收稿日期:2014-11-11,修回日期:2014-12-12

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0204-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.012