霍山石斛組培苗移栽后微觀結(jié)構與微區(qū)元素的變化研究

*通信作者:方炎明,博士,教授,博士生導師,主要從事植物發(fā)育生物學與環(huán)境生物學研究。E-mail:jwu4@njfu.com.cn

霍山石斛組培苗移栽后微觀結(jié)構與微區(qū)元素的變化研究

楊靜1,2,方炎明2*,陳乃富3

(1 南京林業(yè)大學 現(xiàn)代分析測試中心,南京 210037;2 南京林業(yè)大學 生物與環(huán)境學院,南京 210037;3 皖西學院 生物與制藥工程學院,安徽六安 237012)

摘要:采用掃描電鏡及X射線能譜儀技術,研究霍山石斛組培苗移栽后各器官組織的微觀結(jié)構和所含元素的變化,以了解霍山石斛組培苗生長發(fā)育以及藥效成分的狀況。結(jié)果表明:(1)霍山石斛組培苗移栽2個月后,根增粗近1倍,具有根被,且根被細胞壁的網(wǎng)絡狀增厚更加明顯,表皮、皮層、中柱發(fā)育分化更加完善,Mg、Si、Cl、S、K、Ca元素含量提高,其中 Ca增長了2.76倍。(2)莖表面縱向凹陷增多,內(nèi)部結(jié)構致密,維管束發(fā)育較為完善,細胞內(nèi)充滿物質(zhì),Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素含量增多,尤其是K和Fe分別增長了3.25倍和4.61倍。(3)葉增厚,具有了角質(zhì)層,氣孔形狀更加飽滿,葉肉細胞內(nèi)含物豐富,Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Mn、Zn的含量顯著上升,其中K升高了17倍。(4)與根、葉相比,莖中所富集的元素種類最多。研究認為,霍山石斛試管苗移栽后,生長發(fā)育趨向完善,各項功能增強,細胞內(nèi)含物質(zhì)增多,元素成分豐富并且含量提高,體現(xiàn)出對移栽環(huán)境的良好適應性。

關鍵詞:霍山石斛;組培苗;移栽;微觀結(jié)構;元素

收稿日期:2014-10-21;修改稿收到日期:2015-01-12

基金項目:江蘇省林業(yè)三新工程項目(lysx[2013]07)

作者簡介:楊靜(1980-),女,博士,講師,主要從事植物發(fā)育生物學與植物電鏡技術研究。E-mail:yjnjfu@126.com

中圖分類號:Q944.5 文獻標志碼:A

Changes in Micro-structure and Micro-area Elements of

Post-transplantation Plantlets fromDendrobiumhuoshanense

YANG Jing1,2,FANG Yanming2*,CHEN Naifu3

(1 Advanced Analysis and Testing Center,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2 College of Biology and the Environment,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;3 College of Biology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Luan,Anhui 237012,China)

Abstract:Dendrobium huoshanense tissue culture seedlings were transplanted to field environment.In order to get better understanding of thedevelopment and officinal components in the plantlets,we investigated the changes in micro-structure of roots,stems and leaves by SEM after 2 months.The elements in these organs were analyzed by means of Energydispersive Spectrometer.(1)After comparing with tissue culture seedlings,we found robust post-transplantation plantlets with nearlydoubled roughness of roots,the obvious velamina and root cells with significant cellulose network thickening of the velamina cell wall.The structure of epidermis,cortex,and steledeveloped more perfectly,meanwhile the contents of Mg,Si,Cl,S,K and Ca in roots markedly raised,among which Ca grew 2.76 times.(2)Healthy stems were characterized by several features such as conspicuous surface longitudinaldepressions,compact anatomical structure,obviously scattered vascular bundles,and full stem cells with abundant inclusions.The contents of Mg,Si,Cl,S,K,Ca,Fe,Cu and Zn increased significantly,with a 3.25 times increase in K and a 4.61 times increase in Fe.(3)Leaves were found with conspicuous thickening,full stomata,and richer inclusions in mesophyll cells.A significant increase of element contents in leaves was found for Mg,Si,Cl,S,K,Ca,Fe,Mn and Zn,with a 17 times increase in K.(4)More elements were accumulated in stems than in roots and leaves before or after transplanting.In summary,plants grew more perfectly and each function enhanced.Cell content got much richer.More elements in plants and the contents of most elements increased.Those indicated good adaptability of D.huoshanense tissue culture seedlings for the transplanting environment.

Key words:Dendrobiumhuoshanense;tissue culture seedlings;transplantation;micro-structure;element

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗名米斛,又稱龍頭鳳尾草,為蘭科石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物,主產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽霍山[1],具極高的觀賞和藥用價值,自古以來被認為是藥用石斛中的珍品[2-4],享有“中華仙草之最”的美譽[5]。但由于其對生活環(huán)境的要求極為苛刻,且自身生長緩慢,加之遭到過度采挖,野生資源瀕臨滅絕[1,5]。因此,研究霍山石斛資源的可持續(xù)開發(fā)和利用至關重要。

自20世紀50年代末以來,國內(nèi)關于霍山石斛的報道很多,主要集中在快繁、資源鑒定、遺傳育種、藥用成分和藥理藥效方面[6-18],而電鏡下各器官組織的微觀結(jié)構以及所含元素的定性定量分析極少。本研究擬采用先進的掃描電鏡及X射線能譜儀(SEM/EDS)技術,觀察霍山石斛試管苗移栽前后各器官組織的微觀結(jié)構特征,并快速檢測選定區(qū)域的元素種類以及含量,通過原位分析,一方面掌握其對新環(huán)境的適應程度,另一方面了解移栽馴化后藥效成分的狀況。研究結(jié)果不僅為霍山石斛快繁體系的構建提供技術參考,而且為霍山石斛高產(chǎn)并保證藥用品種價值提供科學依據(jù)。

1材料和方法

1.1　材　料

霍山石斛試管苗取自皖西學院生物與制藥工程系石斛組培室,在南京林業(yè)大學植物組培室進行培養(yǎng)。移栽前,將完整植株與容器一起轉(zhuǎn)移到半遮蔭的自然環(huán)境中鍛煉5d,然后打開容器口噴灑少量自來水,保持2d之后再移栽。通過篩選,確定組培苗移栽馴化基質(zhì)為腐樹皮加蘭花石(2∶1),濕度控制在65%左右。移栽前的組培苗選取部分完整植株以及適量的根、莖、葉材料進行前期樣品制備,煉苗2個月后對移栽苗進行取樣,方法同上。

1.2　方　法

1.2.1根、莖、葉的微觀結(jié)構與元素分析每種新鮮材料分別切取5個長×寬×高≤1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的塊狀樣品,裝在大小適當?shù)匿X盒里迅速投入液氮速凍固定[19],約1.5 min后取出樣本立即進行真空冷凍干燥36 h,干燥后的材料,表面經(jīng)日本HITACHI E1010離子濺射儀噴鍍黃金1 min,電流15 mA,使用美國FEI QUANTA200環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察微觀形貌(加速電壓15 kV),同時結(jié)合英國OXFORD INCA X-Act能譜儀進行微區(qū)元素分析,加速電壓20 kV,每個試樣選取5個不同部位,最終結(jié)果取平均值(元素含量用質(zhì)量百分比表示)。

1.2.2整株材料的元素分析將完整植株自然晾干,研磨成粉末狀,經(jīng)日本HITACHI E1010離子濺射儀噴鍍黃金1 min,電流15 mA,使用英國OXFORD INCA X-Act能譜儀進行微區(qū)元素分析,加速電壓20 kV,分別選取5個不同部位,最終結(jié)果取平均值(元素含量用質(zhì)量百分比表示)。

2結(jié)果與分析

2.1　霍山石斛組培苗移栽前后的微觀結(jié)構觀察

形態(tài)結(jié)構是能夠直接反映植株生長狀況的重要指標。本試驗使用掃描電子顯微鏡對移栽前試管苗和移栽后植株的根、莖、葉表面與剖面進行了觀察分析,結(jié)果見圖版Ⅰ。

霍山石斛組培苗移栽前(圖版Ⅰ,1、2)和移栽后(圖版Ⅰ,3、4)根的形態(tài)結(jié)構上均沒有發(fā)現(xiàn)根毛結(jié)構,移栽后根明顯增粗,平均直徑達到1 mm左右,而移栽前只有400～500 μm。移栽后根橫剖面(圖版Ⅰ,4)與移栽前(圖版Ⅰ,2)比較,明顯可見根被的4～5層細胞,皮層、中柱結(jié)構更加清晰,界線較為分明,表明分化發(fā)育趨向完善,外皮層細胞壁明顯增厚,皮層組織中間的薄壁細胞較大、近圓形,腔內(nèi)含有一些物質(zhì),中柱分布面積較小,初生木質(zhì)部和初生韌皮部排列較為緊密,而移栽前的橫切面未見明顯的根被組織。但移栽后根被表皮有破損,清晰呈現(xiàn)出纖維素網(wǎng)絡狀加厚的細胞壁,而且網(wǎng)絡狀排列比之前密度加大(圖版Ⅰ,5、6)。

霍山石斛試管苗莖的表面發(fā)現(xiàn)有縱向凹陷(圖版Ⅰ,7),而橫切面周緣還比較平滑(圖版Ⅰ,8)。煉苗2個月后,莖整體增粗近30%,莖表面的縱向皺褶增多 (圖版Ⅰ,9),并且導致圓形橫切面的周緣呈陡波狀 (圖版Ⅰ,10),與移栽前明顯不同。試管苗莖橫切面的細胞排列(圖版Ⅰ,8)較為疏松,基本組織的細胞腔清晰可見,外韌有限維管束散生在基本組織中,呈不規(guī)則分布,而移栽馴化后,橫切面的結(jié)構變得異常致密,基本組織薄壁細胞的內(nèi)含物豐富,外韌有限維管束散生且數(shù)量較多,導管結(jié)構完善,并且數(shù)量增多(圖版Ⅰ,10)。

霍山石斛的葉,氣孔只分布于下表皮。葉的下表皮均沒有觀察到表皮毛結(jié)構(圖版Ⅰ,11、12)。試管苗的葉(圖版Ⅰ,11)不具角質(zhì)層,氣孔微突,大多張開并且開度大,氣孔密度為2.48×102/mm2。移栽后葉(圖版Ⅰ,12)表皮細胞壁增厚,具有一定的角質(zhì)化程度,有角質(zhì)層,表皮細胞呈飽滿的卵形,排列整齊,氣孔有的張開,有的閉合,并且體積整體比移栽前小,隨著葉面積的增大,氣孔密度減少為2.07×102/mm2。葉的橫切面(圖版Ⅰ,13、14)均顯示沒有海綿組織與柵欄組織的分化,為等面葉。試管苗葉的厚度約為193.49 μm,葉脈維管束已形成,大小不等,相間排列于葉肉中,上表皮細胞柱形,下表皮細胞扁長,整體細胞排列疏松,細胞腔內(nèi)物質(zhì)較少(圖版Ⅰ,13)。移栽后葉厚度約為292.46 μm,比移栽前增厚51%,葉切面(圖版Ⅰ,14)顯示上下表皮細胞均近圓形,葉肉細胞排列較緊密,細胞腔內(nèi)可見較多的絮狀物質(zhì),細胞內(nèi)含物質(zhì)豐富。對氣孔進行放大,發(fā)現(xiàn)試管苗的氣孔整體偏長,保衛(wèi)細胞腎形,副衛(wèi)細胞發(fā)育不完善(圖版Ⅰ,15),移栽苗的氣孔器近圓形,保衛(wèi)細胞和副衛(wèi)細胞形態(tài)飽滿,屬四列型 (圖版Ⅰ,16)。分別對葉的切面結(jié)構放大4 000倍,進一步驗證試管苗葉肉細胞內(nèi)含物質(zhì)較少(圖版Ⅰ,17),而移栽后顯著增多,并且充滿整個細胞腔(圖版Ⅰ,18)。總之,微觀結(jié)構比較發(fā)現(xiàn)移栽后的植株結(jié)構進一步發(fā)育完善,光合功能逐步正常,各項代謝增強,細胞內(nèi)也就會積累較多的產(chǎn)物。

2.2　霍山石斛移栽前后的元素分析

應用X射線能譜儀(energydispersive spectrometer,EDS)利用特征X射線對霍山石斛試管苗移栽前后完整植株以及根、莖、葉器官組織中某些元素含量進行原位的定性定量分析,具體數(shù)據(jù)比較見表1。

由表1可知,移栽前后,同類器官組織中同種元素的含量多數(shù)存在明顯差異。移栽2個月后,根中Mg、Si、Cl、S、K、Ca元素含量顯著提高,其中 Ca最明顯,增長了2.76倍;莖中Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素含量顯著增多,尤其是K和Fe,分別增長了3.25倍和4.61倍,Mg、Cl幾乎是從無到有;葉中所含元素Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Mn、Zn的含量也上升顯著,其中K含量甚至升高了17倍,Fe元素也幾乎是從無到有。

表1　元素含量比較(質(zhì)量百分比)

注:*表示移栽前和移栽后同類器官組織中同種元素的含量在0.05水平上差異顯著;字母表示相同時期不同器官組織中同種元素的含量在0.05水平上的差異顯著性。

Note:The*indicated significantdifference of element contents in the same organs before and after transplanting at 0.05 level.Thedifferent letters indicated significantdifference of element contents in thedifferent organs in the same period at 0.05 level.

根據(jù)表1數(shù)據(jù)比較顯示,大多元素在同時期不同器官組織中的含量也差異顯著。對于移栽前的試管苗而言,Na、Si、P、K、Ca、Mn、Fe、Zn元素在莖中的含量都明顯偏高,其次是根,另外Cl、Cu元素在根中也比較集中,而葉中Mg、S元素的含量稍高,可能與葉綠素、光合蛋白富集于葉有關。移栽馴化之后,莖中Mg、Si、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Zn元素都比根、葉中含量高,其次是葉,此外,葉還富集Cl、Cu元素。

從植株整體的元素含量(表1)來看,移栽后苗中Mg、Si、S、Cl、K、Ca元素含量明顯升高,其中K、Ca元素尤為顯著,Na、P下降,而微量元素Fe、Zn含量都呈上漲趨勢,Mn、Cu元素略有減少。由此可見,霍山石斛試管苗移栽馴化后,如果生長條件合適,將會含有豐富的有益元素并且多數(shù)元素還會增多。

總之,移栽后根、莖、葉中多數(shù)有益元素含量都明顯比移栽前增多,尤其是K、Ca以及微量元素Mn、Fe、Cu、Zn。這些元素成分在一定程度上都有益于人體健康。

3討論

3.1　霍山石斛組培苗移栽后微觀結(jié)構適應性變化

組織培養(yǎng)是保存珍貴野生植物資源、實現(xiàn)規(guī)模化栽培的重要手段之一,而其中的關鍵環(huán)節(jié)是試管苗的脫瓶移栽[20-22]。對于霍山石斛,因?qū)ιL環(huán)境的要求極為苛刻,移栽后通常會出現(xiàn)苗弱、成活率低的現(xiàn)象,所以如何成功進行移栽至今仍是瓶頸問題,亟待解決[2,13-14]。

試管苗離開養(yǎng)分充足的無菌培養(yǎng),轉(zhuǎn)移到條件相對比較惡劣的栽培環(huán)境,需要一個逐步適應的過程。環(huán)境能夠塑造植物體的形貌形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構,所以形貌結(jié)構的變化最能直接反映植物的生長發(fā)育狀態(tài),從而顯示出對生長環(huán)境的適應情況,只有適應生長環(huán)境才能得以繁衍生息[23-25]。本試驗發(fā)現(xiàn)移栽后,根部最顯著的特征是具有明顯的根被組織,而移栽前幾乎沒有。根被由厚壁死細胞組成,細胞壁木栓化,主要起保護、吸水、透氣和儲藏水分的功能[26],有研究表明附生蘭根被細胞的層數(shù)和厚度會受環(huán)境濕度變化的影響[27]。本試驗所取的移栽前組培苗,根可能處于形成發(fā)育的早期,并且生長在水分充足的環(huán)境中,不具備形成根被的條件,移栽后,一是因為本身的生長發(fā)育到了一定階段,另外,環(huán)境濕度的明顯減小,也促進根被的形成。同時,移栽后,根被外層部分細胞有破損,明顯呈現(xiàn)出纖維素網(wǎng)絡狀增厚的細胞壁,并且網(wǎng)絡狀排列密度增大,表明機械強度的增加。根增粗將近1倍,從橫剖面還可見細胞更為飽滿并且體積增大,表皮、皮層、中柱結(jié)構更加清晰,發(fā)育狀況良好,根被外層部分細胞壁的破損并沒有影響正常的生長發(fā)育,顯示出根被強大的保護作用。此外,移栽后,莖的表面縱溝增多,內(nèi)部結(jié)構變得致密,維管組織發(fā)育更加完善,細胞內(nèi)含物質(zhì)豐富,為后期成為藥用部分奠定基礎。組培苗一直生長在營養(yǎng)和水分充足的條件下,自養(yǎng)能力差,輸導組織不發(fā)達,水分吸收、運輸?shù)哪芰Φ?出瓶后極易因過度失水而萎蔫甚至導致死亡,本試驗中,移栽后,隨著葉片的增長,氣孔體積卻有所減小,也許是植物本能的反應,通過減小氣孔器體積降低水分蒸發(fā),避免失水,以逐漸適應當前的新環(huán)境。隨著結(jié)構發(fā)育的逐步完善,光合功能增強,代謝增多,葉肉細胞內(nèi)含物更加豐富,物質(zhì)的大量累積也表明各項功能的有效進行。

因此,總體來說,移栽苗的微觀結(jié)構發(fā)育趨向完善,植株各項功能日益增強,體現(xiàn)出對環(huán)境的良好適應性,表明試驗所設置的栽培環(huán)境目前還較為合適。

3.2　霍山石斛組培苗移栽后所含元素的狀況

石斛具有滋陰清熱,益胃潤肺、止渴生津等神奇功效,這與其所含有效成分的作用密不可分[3,28]。在中草藥藥理活性物質(zhì)的研究過程中,人們發(fā)現(xiàn)元素在不同程度上協(xié)同發(fā)揮抗氧化、抗衰老、提高免疫力等各種療效[29-30]。EDS可以對除H、He元素以外的所有元素進行定性定量分析,具有簡便快捷,準確穩(wěn)定的優(yōu)點[31-32]。本試驗通過EDS測得霍山石斛含有許多人體必需的元素,并且移栽后,大多元素含量都明顯增加,尤其是K、Ca以及微量元素Mn、Fe、Cu、Zn。作為藥用部分的莖,所含元素非常豐富,并且Mg、Si、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Zn含量明顯高于根、葉器官,而Cl、Na、Cu較集中于葉,根含元素種類也較多,這些元素無論對植物本身還是對人體來說都是維持生命的必需元素,因此由本試驗的結(jié)果來看,根、葉的藥用價值也值得關注。據(jù)報道,Mg、K還有利于提高氨基酸的含量[33]。Mn、Fe、Cu、Zn是人體必需的微量元素,其中Zn參與多種酶的合成,Mn參與肌體的代謝,Fe是構成血紅蛋白、過氧化氫酶的重要成分,也是很多酶的活性部分,盡管在人體內(nèi)都含量極少,但對維持人體中一些決定性的新陳代謝起著重要作用,一旦缺少就會出現(xiàn)疾病,甚至危及生命,在抗病、防癌、延年益壽等方面的作用不容忽視[34-35]。因此,許多研究者提出微量元素也是中藥的有效成分,把中藥功效的物質(zhì)基礎分為二大類,一類是生物活性成分,另一類是微量元素,認為藥物達到歸經(jīng)部位是通過微量元素向病變部位的遷移、富集和親和運動來實現(xiàn)的[35-38],可見微量元素的重要性,所以石斛的神奇藥效必然有微量元素的功勞。

本試驗中,霍山石斛移栽苗的體內(nèi)富含了多種與藥效相關的元素成分,尤其是通常作為藥用部分的莖,所含元素非常豐富,但最終能達到的藥效程度如何,與野生資源的功效有無差距等,還有待于進一步深入研究。

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Explanation of plate:

Plate ⅠThe microscopic morphology on the root,stem and leaf ofD.huoshanense

xy.Xylem;ph.Phloem

Fig.1.The surface of the root before transplanting;Fig.2.The cross section of the root before transplanting;Fig.3.The surface of the root after transplanting;Fig.4.The cross section of the root after transplanting;Fig.5.The surface cells of the root before transplanting;Fig.6.The surface cells of the root after transplanting;Fig.7.The surface of the stem before transplanting;Fig.8.The cross section of the stem before transplanting;Fig.9.The surface of the stem after transplanting;Fig.10.The cross section of the stem after transplanting;Fig.11.The surface of the leaf before transplanting;Fig.12.The surface of the leaf after transplanting;Fig.13.The cross section of the leaf before transplanting;Fig.14.The cross section of the leaf after transplanting;Fig.15.The stomatal of the leaf before transplanting;Fig.16.The stomatal of the leaf after transplanting;Fig.17.The mesophyll cells before transplanting;Fig.18.The mesophyll cells after transplanting.

圖版 Ⅰ霍山石斛根、莖、葉的微觀形貌

xy.木質(zhì)部;ph.韌皮部

1.移栽前根的表面;2.移栽前根的橫切面;3.移栽后根的表面;4.移栽后根的橫切面;5.移栽前根表皮細胞;6.移栽后根表皮細胞;7.移栽前莖的表面;8.移栽前莖的橫切面;9.移栽后莖的表面;10.移栽后莖的橫切面;11.移栽前葉的表面;12.移栽后葉的表面;13.移栽前葉的橫切面;14.移栽后葉的橫切面;15.移栽前葉氣孔;16.移栽后葉氣孔;17.移栽前葉肉細胞;18.移栽后葉肉細胞。