基于多波長覆蓋融合指紋圖譜的大川芎片主要成分研究

基于多波長覆蓋融合指紋圖譜的大川芎片主要成分研究

唐爽1，包永睿1,2,3，孟憲生1,2,3，富力4，王帥1,2,3

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；

3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600；4.大連富生天然藥物開發有限公司，遼寧 大連 116600)

摘要：目的建立10批次大川芎片多波長融合高效液相色譜指紋圖譜，在此基礎上對大川芎片融合指紋圖譜共有峰進行初步指認，構建大川芎片的全析指紋圖譜為其全面的質量控制提供依據。方法采用高效液相色譜法對大川芎片進行檢測，將不同波長下數據進行多波長融合得到10批大川芎片的融合指紋圖譜，采用液質聯用技術對融合指紋圖譜中的共有峰進行初步結構鑒定。結果10批大川芎片融合指紋圖譜共獲得13個共有峰并與共有模式圖相似度均>0.92，其中8個共有峰得到指認。結論本文通過多波長融合技術手段及HPLC-MS分析方法建立大川芎片全析指紋圖譜，為大川芎片主要成分的質量控制提供依據，為規范中藥制劑及其合理使用奠定基礎。

關鍵詞：大川芎片；多波長融合；指紋圖譜；液質聯用

基金項目：“十二五”“重大新藥創制”科技重大專項(No.2013ZX09507005)

作者簡介：唐爽，女，研究方向：藥物分析，E-mail：707547627@qq.com

通訊作者：孟憲生，男，博士研究生，博士生導師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學及藥品質量分析，Tel：0411-85890185，E-mail：mxsvvv@126.com

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A

Study on the main components of the Dachuanxiong Tablets based

on multiple wavelength coverage fusion fingerprint

TANGShuang1,BAOYong-rui1,2,3,MENGXian-sheng1,2,3,FULi4,WANGShuai1,2,3

(1.CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；

2.LiaoningProvinceMulti-ComponentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，

Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchand

EngineeringLaboratory，Dalian116600，China;4.DalianFushengNaturalDrug

DevelopmentCo.,Ltd.，Dalian116600，China)

Abstract：ObjectiveTo set up the multi-wavelength fusion HPLC fingerprint of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets,common peaks were preliminary identified on that basis,building the total analyzed fingerprint in order to provide a base for the comprehensive quality controlling of the drug.MethodsThe fingerprint under different wavelength for ten batches of Dachuanxiong Tablets were tested by HPLC-DAD and the active components was identified by HPLC-MS.ResultsA HPLC fingerprinting pattern of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets was set up based on multi-wavelength fusion,which demarcated 13 common peaks,8 of which were confirmed,the similarity was more than 0.92 between the correlation coefficients of the 10 samples.ConclusionIn this article,with the method of multi-wavelength fusion and HPLC-MS,we established the total analyzed fingerprint of Dachuanxiong Tablets and provided the foundation for the quality controlling of the tablets,which laying a foundation to regulate traditional Chinese medicine preparations and its reasonable application.

Key words:Dachuanxiong Tablets；Multiple wavelength fusion；Fingerprint；HPLC-MS

大川芎片由天麻、川芎兩味藥材組成，經提取、精制等一系列工藝處理后制成，具有活血化淤、平肝熄風之功效，專門用于治療各種頭痛和眩暈，療效確切、毒副作用少，已廣泛應用于臨床。該制劑組方藥材成分復雜，單一成分、單一波長測定不能全面、綜合的評價其質量，因此建立綜合、全面、有效的質量評價標準具有重大的意義。中藥指紋圖譜是中藥質量控制的有效技術手段，大川芎片中的有效成分在單一波長下難以全面反映，故本研究采用多波長融合技術建立大川芎片多波長融合指紋圖譜，并通過高效液相色譜-質譜聯用技術對其化學成分進行分析，建立全析指紋圖譜的質量控制體系，為大川芎片及中藥制劑質量控制提供新的科學依據。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司，包括高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Agilent 1100 色譜工作站)；HPLC-TOF-MS(美國安捷倫科技公司)。

1.2試藥天麻素對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110807-201306)；大川芎片(大連富生制藥有限公司，批號：20120601、20121101、20130301、20130401、20130501、20130901、20131101、20140201、20140301、20140601)。乙腈(色譜試劑，Fisher公司，批號：110906)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110409)；水為超純水。

2方法與結果

2.1大川芎片多波長融合指紋圖譜

2.1.1色譜條件Aglient TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.04%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0~10 min，2%-2%(B)，10~90 min，2%-24%(B)；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長：210、225、254、270、320 nm，進樣量：10 μL[1]。

2.1.2對照品溶液的制備取天麻素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取大川芎片適量，去除包衣，研碎，過40目篩，精密稱取樣品粉末2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加甲醇80 mL回流提取2 h，濾過，濃縮，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.4檢測波長的選擇及多波長指紋圖譜融合[2]光譜波長范圍的選取DAD設定為200～400 nm全波長掃描。取供試品溶液，按設定的色譜條件進樣測定。用所得的三維色譜-光譜數據，可知，大川芎片的色譜信號以紫外光區為主，大川芎片中的主要成分分別在210、225、254、270、320 nm下有較大吸收，故確定融合波長為210、225、254、270、320 nm。

分別從 Aglient 1100色譜工作站中導出210、225、254、270、320 nm的dif格式數據文件，使用Matlab軟件編程，對dif格式數據進行全時段多波長融合，得到同時反映5個波長信息的色譜圖和圖譜數據，相關色譜圖見圖1。

2.1.5精密度試驗取同一批供試品溶液(批號：20140301)，連續進樣6次，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.6穩定性試驗取同一批供試品溶液(批號：20140301)，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進行檢測，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明該樣品穩定性良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.7重復性試驗分別取同一批號(批號：20140301)樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液并進行檢測，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明該制備和檢測方法重復性良好，符合指紋圖譜要求。

2.2指紋圖譜的建立、參照峰及特征峰的選擇取10批大川芎片制劑，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別取10 μL，按“2.1.1”項下方法進樣，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，將10批大川芎片的指紋圖譜數據導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)，選擇色譜峰進行多點校正、色譜峰自動匹配后，以中位數法生成HPLC指紋圖譜共有模式(圖2)。結果表明10批樣品的指紋圖譜與共有模式的相似度分別為0.958、0.959、0.961、0.952、0.968、0.960、0.948、0.933、0.968、0.962，且相似度均>0.920。對色譜峰進行分析，選擇穩定性、重復性好、特征明顯的色譜峰為共有，共標定13個共有峰(圖3)，共有峰面積占本文所示指紋圖譜總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜共有峰的要求。其中峰S經對照品比對為天麻素色譜峰，該峰峰面積較大，重復性、穩定性較好，因此選擇該峰為指紋圖譜的參照峰。

2.3采用液質聯用技術推斷大川芎片中主要化學成分

2.3.1樣品制備方法對照品制備方法見“2.1.2”項下。供試品制備方法見“2.1.3”項下。

2.3.2分析方法

2.3.2.1液相條件的選擇見“2.1.1”項下色譜條件。

圖1　大川芎片及天麻素對照品融合前后指紋圖譜 大川芎片：A.210 nm;B.225 nm;C.254 nm;D.270 nm;E.320 nm；F.大川芎片多波長融合指紋圖譜；G.多波長融合天麻素對照品圖譜

圖2　10批大川芎片的多波長融合指紋圖譜共有模式圖

圖3　大川芎片融合指紋圖譜

2.3.2.2質譜條件的選擇電噴霧離子源(Dual ESI)，正、負離子模式檢測，干燥氣體流速為10 L·min-1，干燥氣體溫度為350 ℃，毛細管電壓(Vcap)為3 500 V，霧化器壓力為50 psig，碎裂電壓為110 V，Skimmer 為65 V，OCT IRF Vpp為250 V，m/z范圍為50~2 000。

2.3.3結果取大川芎片供試品溶液按“2.3.2”項下分析方法進行液質聯用分析，應用HPLC-MS聯用技術，并參考相關文獻和對照品比對，對大川芎片融合指紋圖譜中共有峰初步定性。通過質譜指認和對照品比對，共初步鑒定了8個共有峰，結果見表1[3~8]。

表1　大川芎片主要化學成分HPLC-MS數據及化合物推測

3討論

大川芎片質量標準中的指標性成分為天麻素，而其來源于大川芎片中天麻藥材，天麻為名貴中藥材，為避免市場魚目混珠，故建立多波長融合指紋圖譜并對其主成分初步定性分析，建立全面的質量控制體系來控制樣品質量，解決實際生產

問題，從而降低檢測限、克服單一波長下信息量不足的缺點。

本實驗考察水、70%甲醇、甲醇不同溶劑對樣品的提取，結果表明不同提取溶媒對樣品成分存在較大差異，大川芎片中天麻、川芎兩味藥材水溶性極性大的成分較多，其中水、70%甲醇提取樣品色譜峰雜，分離度不好，故采用純甲醇進行提取。大川芎片制劑中強極性成分較多并且在低波長225 nm下吸收較為明顯，故選擇乙腈-水系統初始梯度為98%水相分離效果較好，基線較為平穩。

本文通過多波長融合技術手段及HPLC-MS分析方法建立了大川芎片全析指紋圖譜，與傳統的僅以一種化學成分為參照峰作相對定量的指紋圖譜相比，該法更能真實客觀的反映大川芎片的內在質量，它使得指紋圖譜中獲得的峰得到辨認，是一種潛移默化的從相對定量到絕對定量的提升，為以后大川芎片及中成藥的質量控制和物質基礎研究提供新的參考依據。

參考文獻：

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