ABO血型基因分型在白血病患兒疑難血型鑒定中的應用

ABO血型基因分型在白血病患兒疑難血型鑒定中的應用

葉星晨，張帆，顧玉微，傅啟華，王靜

(上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心檢驗科，上海 200127)

摘要：目的將基因分型技術應用于白血病患兒的疑難血型鑒定中，有效避免疾病等外在因素的干擾，準確鑒定ABO血型，保障患者的輸血安全。方法ABO血型血清學鑒定采用微柱凝膠法。提取全血DNA，利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增ABO基因 1~7號外顯子、增強子和啟動子區序列，進行直接測序，測序結果與血型基因變異位點數據庫(Blood Group Antigen Gene Mutation Database)比較，進行ABO血型基因分型。結果1例患兒血清學實驗結果可能為A亞型，基因分型結果為A102/O01，確認為A型。另1例患兒血清學實驗結果可能為B亞型，基因分型結果為B101/O01，確認為B型。2例患者均輸注相應血型紅細胞制品，無任何不良反應。結論該2例患兒因疾病造成ABO血清學鑒定正反定型不符，血型難以鑒定，應用ABO血型基因分型技術則能準確鑒定患者的血型，保證輸血安全、有效。

關鍵詞：ABO 血型；基因型；表現型；疑難血型

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-0993-05R446.1

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.007

Abstract:ObjectiveTo identify type discrepancy blood accurately by applying genotyping technique in leukemia children for ABO blood type identification, avoiding the interference of disease and other factors, ensuring transfusion safety. MethodsMicro-column agglutination was used for ABO blood type serological identification. The DNA was extracted from whole blood of leukemia children. Exon 1-7, enhancer and promoter regions of ABO gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR). PCR products were directly sequenced， and the results were compared with those of the Blood Group Antigen Gene Mutation Database to identify ABO genotyping. ResultsThe serological result of 1 leukemia children might be subgroup A, genotype A102/O01, so it was identified as A blood type. The another serological result might be subgroup B, genotype B101/O01, so it was identified as B blood type. Red cell products of compatible blood type were transfused to the 2 patients without any adverse reaction. ConclusionsThe results of forward and reverse tests for the 2 children are not accordant because of diseases, which make us hard to identify blood type. However, it helps us with ensuring the transfusion safety and effectivity by ABO genotyping technique.

作者簡介：葉星晨，女，1989年生，學士，主要從事臨床輸血工作及相關方向研究 。

通訊作者：王靜，聯系電話：021-38625548。

收稿日期：(2014-12-15)

Application of ABO genotyping in the identification of type discrepancy blood in children with leukemiaYEXingchen,ZHANGFan,GUYuwei,FUQihua,WANGJing.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren′sMedicalCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: ABO blood type; Genotype; Phenotype; Discrepancy blood type

有關白血病患者血型抗原減弱或抗體效價降低的報道并不少見，臨床上應用常規血清學血型鑒定時往往容易發生誤判而影響臨床輸血安全。白血病患者血型抗原弱化這一現象的真正原因目前還不甚明了。血型基因分型，不僅可以避免疾病、輸血等外在因素對血型鑒定的干擾，還可能從分子水平上分析血型抗原變化的原因，準確鑒定患者的血型，以保障輸血安全、有效。我們應用ABO血型基因分型技術，對2例白血病患兒疑難血型進行了鑒定。

材料和方法

一、研究對象

2例白血病患兒均為上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心血液腫瘤科住院治療患者。病例1為14歲患兒，男性，臨床診斷為急性非淋巴細胞白血病(M2b)。病例2為2歲患兒，臨床診斷為非霍奇金淋巴瘤。輸血前血清學血型鑒定均為正反定型不符，血培養結果及輸血傳染病指標檢查均為陰性。

二、方法

1. 標本采集采集患者靜脈血標本，以0.109 mol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝，用于抽提DNA，-80℃凍存。

2.儀器與試劑WADiana/8XT 全自動血型儀、DG Gel Confirm卡、DG Gel Neutral卡及DG Gel Coombs卡為西班牙Diagnostic Grifols S.A公司產品。抗球蛋白試劑、單克隆抗A抗體、單克隆抗B抗體、人源抗A抗體、人源抗B抗體、單克隆抗H抗體、人ABO血型反定型用紅細胞試劑盒、抗體篩查細胞為上海血液生物醫藥有限責任公司產品。快速抽提血液基因組試劑盒(Rapid Blood Genomic DNA Isolation Kit)為上海生工生物有限公司產品；引物設計參照美國國立生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因庫(GenBank)中ABO基因序列(序列號FR828573.1)，由華大基因公司合成，序列見表1。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) 擴增試劑為C-TaKaRa(大連寶生物) 公司產品。儀器為Bio-rad C1000Thermal Cycle PCR擴增儀。

表1　ABO血型基因分型引物序列

3. 血型血清學實驗(1)微柱凝膠法：進行ABO血型鑒定、直接和間接抗人球蛋白試驗、抗體篩查;(2)試管法：進行H抗原鑒定、人源性A抗原和B抗原鑒定。試驗方法參照文獻[1]進行。

4. 血型基因分型從患者全血中提取基因組DNA，利用PCR擴增ABO1~7號外顯子、增強子和啟動子區序列。總反應體系為25 μL，其中Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，10 reaction buffer 2.5 μL，dNTP mix (10 mmol/μL) 2 μL，上下游引物(10 mmol/μL)各1μL，DNA模板 1 μL以及ddH2O 17.3 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min后95 ℃ 變性30 s，62℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s， 35個循環后 72 ℃ 5 min。反應產物由華大基因公司測序。測序結果與血型基因變異位點數據庫(Blood Group Antigen Gene Mutation Database)比對，以A101為標準序列判斷其血型基因型。

結果

一、血型血清學實驗結果

患兒1紅細胞在微柱凝膠法中與單克隆抗A抗體反應為雙群，與單克隆抗B抗體反應呈陰性；試管法中與單克隆抗H抗體反應為陽性，與人源性抗A抗體反應為混合視野，與人源性抗B抗體反應為陰性。其血清不凝集A1型和O型標準紅細胞，與B型紅細胞凝集呈強陽性。該實驗對照為正常A型紅細胞及血清。因此該患兒血清學定型可能為A亞型。患兒2紅細胞在微柱凝膠法中與單克隆抗A抗體反應呈陰性，與單克隆抗B抗體反應為雙群；試管法中與單克隆抗H抗體反應為陽性，與人源性抗A反應為陰性，與人源性抗B抗體反應為混合視野。其血清不凝集B型和O型標準紅細胞，與A1型紅細胞凝集呈強陽性。該實驗對照為正常B型紅細胞及血清。因此該患兒血清學定型可能為B亞型。見表2。直接及間接抗球蛋白試驗均陰性，抗體篩查均陰性。

表2　2例白血病患兒的血清學血型鑒定結果

二、ABO血型基因分型結果

分別對2例患兒ABO基因1~7號外顯子、增強子以及啟動子區域進行PCR擴增及測序，結果參照Blood Group Antigen Gene Mutation Database，以A101為標準序列進行比對。患兒1的6號外顯子存在261delG變異，7號外顯子存在467C>T變異，在其余外顯子以及增強子和啟動子中未發現變異。由467C>T判斷基因型為A102，由261delG判斷基因型為O01，因此該患兒ABO基因分型結果為A102/O01。患兒2的6號外顯子存在261delG、297A>G變異，7號外顯子存在526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、830G>C、930G>A變異，其余外顯子以及增強子和啟動子中未發現變異。由261delG判斷基因型為O01，其余點突變判斷基因型為B101。該患兒ABO 基因分型結果為B101/O01。見表3、圖1。

表3　2例白血病患兒的基因分型結果

討論

有關疾病引起血型抗原變化或抗體效價降低的報道并不少見，其中尤以白血病居多[2-8]。有學者認為，ABO血型基因變異是造成患者血型抗原變化的真正原因[9-11]。正如許多腫瘤疾病都與病毒相關，且人類病毒致癌基因c-abl就位于9號染色體q34位點，腫瘤患者的ABO血型基因很有可能受到病毒基因干擾，而使血型抗原物質的合成受到阻斷。NOVARETTI等[12]分析了108例不同類型白血病患者的ABO血型基因，在其中的25例患者中發現了22個新的ABO等位基因突變型，包括11個單核苷酸突變、12個單堿基插入、6個單堿基缺失和1個相互易位。可見白血病等腫瘤疾病的患者隨著病程的發展確實會引起ABO基因的變異。除此之外，疾病的發生、發展不僅僅引起ABO基因編碼區的突變，更多的是對ABO調控基因的影響[9]。BIANCO-MIOTTO等[13]認為白血病患者血型抗原減弱與啟動子甲基化關系密切。生理情況下，啟動子上的CpG島一般為非甲基化狀態。但當機體發生癌變，CpG島甲基化程度隨之變化，從而影響ABO基因的轉錄表達[14]。CHIHARA等[15]在對膀胱癌患者ABO抗原減弱的研究中發現，隨著患者ABO基因啟動子上CpG島甲基化位置和數目的不同，抗原改變情況亦有不同。

本研究所涉及的2名患兒血清學血型鑒定結果分別為疑似A亞型和疑似B亞型，而他們的

注：圖a、b、c為樣本1測序結果，圖a、b箭頭所示為第6顯子261delG雜合缺失，a為正向測序，b為反向測序，圖c箭頭所示為第7外顯子467C>T雜合變異，圖d、e、f、g、h、i、j、k為樣本2測序結果，圖d、e箭頭所示為第6顯子261delG雜合缺失，d為正向測序，e為反向測序；圖f箭頭所示為第6外顯子297A>G雜合變異(反向)；圖g箭頭所示為第7外顯子526C>G雜合變異；圖h箭頭所示為第7外顯子657C>T雜合變異；圖i箭頭所示為第7外顯子703G>A雜合變異；圖j箭頭所示為第7外顯子796C>A和803G>C雜合變異；圖k箭頭所示為第7外顯子930G>A雜合變異 圖1　2例患兒ABO血型基因測序結果

ABO血型基因型分別為正常A型和B型。然而該2名白血病患兒的基因分型結果與以上報道有所不同，兩者ABO基因外顯子區域并沒有發生新的等位基因變異，且在調控區序列中亦未發現突變，可見其抗原減弱并非由于基因變異引起。血清學實驗中H抗原檢測正常，則顯示并非由于粒系病理性增殖而導致紅系增生受抑引起的血型抗原的減弱。因此，本研究推測可能是由于在癌變的過程中，A、B抗原的糖基轉移酶活性降低，導致部分A、B抗原合成減少。除排除基因變異引起酶活性降低的可能性之外，還可能是腫瘤細胞的干擾作用，或是由于ABO基因啟動子甲基化影響了基因的正常轉錄。我們對這2名患兒作了隨訪，發現其中的弱A型患兒隨著白血病病情緩解，其A抗原強度恢復正常；另1例弱B患兒病情一直未得到緩解，經救治無效死亡，在院期間多次血清學血型鑒定均顯示B抗原弱表達。

在對疾病引起血型抗原弱化的研究中，還有部分學者則認為白血病患者血型抗原減弱這種現象既沒有從根本上改變紅細胞表面抗原的表達，也不涉及血型基因的變異，是由于紅系增生抑制，代謝受到干擾，AB抗原相對減少。或是由于腫瘤細胞降低了AB抗原特異性糖基轉移酶的活性，導致血型抗原活性的減弱。體內唾液黏蛋白產生過多，黏附和遮蔽紅細胞表面抗原表位亦可導致血型變異，但這種黏蛋白對唾液中的血型物質鑒定影響更大[16]。

ABO血型抗原與白血病的關系已日漸成為研究熱點。TAVASOLIAN等[17]的研究結果顯示在急性淋巴細胞白血病和慢性髓細胞白血病患者中4種不同ABO血型分布差異有統計學差異。而BIANCO-MIOTTO等[13]運用流式細胞術發現約55%的骨髓惡性腫瘤患者由于受疾病干擾影響使得紅細胞表面ABO抗原發生了變化。由于兩者內在的緊密聯系，因此一直以來專家學者們都認為對血型抗原的研究是白血病病因機制探索的一項有效策略。

血液病患者尤其是兒童血液病患者這一特殊群體的輸血安全問題，無疑是備受廣泛關注的。許多惡性血液病患者都需要長期輸血支持，而紅細胞同種免疫則正是引起長期輸血患者急性溶血和輸血有效率降低的主要問題，SANZ等[18]報道約15%的骨髓增生異常綜合征或慢性單核細胞白血病患者長期輸血后會發生紅細胞同種免疫而產生自身抗體。面對這一難題，首先則必須保證對患者的血型作出準確定型，輸注同型血液制品，才能將患者的輸注風險降至最低。

綜上所述，血清學血型鑒定會受到疾病、類血型物質、黏液蛋白等多種原因的影響，造成結果難以判斷，但基因分型技術不受這些因素的干擾，即使面對造血功能抑制引起的血型抗原變化，也能準確定型，保證輸血安全、有效[19-22]。從分子水平分析抗原變化并發現不同疾病中出現的新ABO等位基因變異，無疑是輸血領域未來的發展趨勢，且隨著基因分型技術廣泛而深入的應用，血型抗原與癌癥等疾病的內在聯系也勢必展現在人們眼前。

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(本文編輯：范基農)