乳腺癌循環腫瘤細胞分離鑒定試劑盒的建立

乳腺癌循環腫瘤細胞分離鑒定試劑盒的建立

張健1，馮曉燕2，孫亭亭3，王凱4，張希銳3，高杰鋒3，

梁曉飛4，康向東5，彭俊杰6，張賀秋2，苗朝良7，沈鶴柏3

(1.上海市臨床檢驗中心，上海 2001262；2.軍事醫學科學院基礎醫學研究所生物診斷研究室，

北京 100850；3.上海柏慧康生物科技有限公司，上海 201900； 4.上海交通大學醫學院附屬

仁濟醫院上海市腫瘤研究所，上海 200032；5.上海市普陀區中心醫院檢驗科，上海 200062；

6.復旦大學附屬腫瘤醫院大腸科，上海 200032；7.聊城市腫瘤醫院，山東 聊城 252000)

摘要：目的探討乳腺癌循環腫瘤細胞(CTC)分離鑒定試劑盒中上皮細胞黏附分子(EpCAM)免疫脂質磁球及人乳腺珠蛋白(hMAM)單克隆抗體在乳腺癌CTC分離鑒定中的應用價值。方法將乳腺癌MCF-7細胞混于健康志愿者的新鮮血樣中，采用免疫磁球分離技術分析EpCAM免疫脂質磁球對乳腺癌細胞的分離效果。在強生CellTracks`(?) AutoPrep`(?) CTC檢測儀(簡稱強生Cellsearch`(TM)系統)上進行EpCAM免疫脂質磁球和強生磁球對MCF-7細胞捕獲效率的模擬實驗及乳腺癌患者血液的臨床檢測。結果熒光顯微鏡的觀察結果顯示EpCAM免疫脂質磁球的細胞捕獲能力明顯強于無抗體修飾的納米磁球。激光共聚焦顯微鏡的觀察結果顯示EpCAM抗體修飾可顯著增強磁球捕獲MCF-7細胞的效率和特異性。模擬實驗結果顯示EpCAM免疫脂質磁球對10、20、40、80、150、200個MCF-7細胞的捕獲結果與強生磁球接近；對乳腺癌患者血液中的CTC捕獲效率與強生磁球相當，部分病例要明顯優于強生磁球。結論構建的基于EpCAM免疫脂質磁球和hMAM單克隆抗體的CTC分離鑒定試劑盒對乳腺癌患者血液中的CTC具有較高的捕獲效率，這將為實現乳腺癌早期診斷、術前、術后分析及治療效果檢測提供了有力的支撐。

關鍵詞：循環腫瘤細胞；上皮細胞黏附分子；免疫磁球；人乳腺珠蛋白

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-1011-06R446.1

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.012

基金項目：上海市科委生物醫藥產業處產學研項目(12DZ1941702)；上海市中小企業技術創新基金資助項目(1302H159400)；第2屆中國創新創業大賽上海張江扶持資金資助項目

作者簡介：張健，男，1970年生，主任技師，博士，主要從事免疫檢驗及質量控制。

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical application significance of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)lipid immune magnetic particles and human breast mammaglobin (hMAM) monoclonal antibody in breast cancer circulating tumor cell (CTC) isolation and identification kit. MethodsBreast cancer MCF-7 cells were mixed in healthy fresh blood samples, and the isolation ability of EpCAM lipid immune magnetic particles on breast cancer was analyzed by immune magnetic particle isolating technique. A comparison between EpCAM lipid immune magnetic particles and Cell Tracks? AutoPrep`(?) System (CellSearch`(TM)) magnetic particles for the capture efficiency of MCF-7 cells was performed in a simulation experiment, and the hematological items were determined. ResultsThe results of fluorescence microscopy showed that the capture ability of EpCAM lipid immune magnetic particle was significantly stronger than that of nanoparticles without antibody. The results of laser scanning confocal microscopy showed that the modification of EpCAM lipid immune magnetic particle antibody significantly enhanced the efficiency and specificity of magnetic particles capturing MCF-7 cells. Simulation experiment results showed that the capturing results of EpCAM lipid immune magnetic particles of 10, 20, 40, 80, 150 and 200 MCF-7 cells were close to CellSearch`(TM) magnetic particles. In the blood samples from patients with breast cancer, the CTC capturing efficiencies of EpCAM lipid immune magnetic particles and CellSearch`(TM) magnetic particles were almost the same, in some cases, the CTC capturing efficiency of EpCAM lipid immune magnetic particles was significantly better than that of CellSearch`(TM) magnetic particles. ConclusionsThe research on the establishment of EpCAM lipid immune magnetic particles and hMAN monoclonal antibody based on CTC isolation and identification kit has high capturing efficiency of CTC in blood samples from patients with breast cancer. It will provide a strong support for the early diagnosis, pre-operation and post-operation analysis and treatment effect evaluation.

收稿日期：(2015-04-07)

Establishment on isolation and identification kit for circulating tumor cells in breast cancerZHANGJian1,FENGXiaoyan2,SUNTingting3,WANGKai4,ZHANGXirui3,GAOJiefeng3,LIANGXiaofei4,KANGXiangdong5,PENGJunjie6,ZHANGHeqiu2，MIAOChaoliang7,SHENHebai3.(1.ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China; 2.BiologicalDiagnosticLaboratory,InstituteofBasicMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China; 3.ShanghaiBaihuikangBio-Sci&TechCo.,Ltd.,Shanghai201900,China; 4.ShanghaiCancerInstitute,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200032,China; 5.DepartmentofClinicalLaboratory,PutuoCentralHospital,Shanghai200062,China; 6.DepartmentofColorectalSurgery,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 7.LiaochengCancerHospital,ShandongLiaocheng252000,China)

Key words: Circulating tumor cell；Epithelial cell adhesion molecule；Immune magnetic particle；Human breast mammaglobin

遷移性是腫瘤的基本特征之一。腫瘤細胞在器官之間的轉移是許多癌癥致死的關鍵原因[1]。腫瘤組織活檢、影像學檢查等方法通常用于腫瘤的診斷及預后判斷，但均有一定的滯后性，難以做到早期篩查[2]。近年來早期篩查主要針對未表現出癥狀的癌癥患者，而這將增加癌癥防治的成功率。美國國家癌癥研究中心的統計數字表明早期篩查能使大腸癌的致死率至少下降60%，使肺癌的致死率下降20%[3]。

上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecules，EpCAM)在上皮癌變過程中發揮重要作用，在多數上皮來源的腫瘤細胞中過表達，而在中胚層來源的血細胞和淋巴細胞中不表達[4-7]。當前多數研究基于EpCAM來初步判定是否為循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)。人乳腺珠蛋白(human breast mammaglobin，hMAM)具有乳腺組織特異性，可應用于乳腺癌早期診斷、判斷預后、微轉移的檢測等，具有很好的臨床應用前景[8-12]。我們構建了基于EpCAM免疫脂質磁球和hMAM單克隆抗體的CTC分離鑒定試劑并進行了初步評價。

材料和方法

一、主要材料和儀器

乳腺癌細胞系MCF-7購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購于美國賽默飛世爾公司；EpCAM抗體購于德國默克公司；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的CK 19抗體購自強生Veridex公司；hMAM單克隆抗體由北京軍事醫學科學院贈送；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液購自碧云天生物技術有限公司；EpCAM抗體衍生物購自上海銳勁生物技術有限公司；磁性納米顆粒購自上海晟納實業有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)購自Avanti公司；膽固醇、二氯甲烷、及其它常用試劑均購自國藥公司。磁力架購自上海柏慧康生物科技有限公司；OLYMPUS B 61熒光顯微鏡；PE標記的CD45抗體(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式細胞儀均為美國BD公司生產；強生CellTracks?AutoPrep?CTC檢測儀(簡稱強生CellsearchTM系統，強生Veridex公司)。

二、方法

1.乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒的組裝采用反向蒸發法制備EpCAM免疫脂質磁球，用粒徑分析儀對EpCAM免疫脂質磁球進行粒徑分析。乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒的主要成分包括EpCAM免疫脂質磁球、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的hMAM單克隆抗體(hMAM-FITC)、DAPI染色液、CD45-PE、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；pH值7.4)、去離子水。乳腺癌CTC分離鑒定步驟：收集腫瘤患者7.5 mL抗凝血，1000×g離心10 min；小心取中上層液置于EP管中，加入與其等量的PBS充分混勻；加入免疫脂質磁球30 μL，室溫孵育30 min，每10 min混勻1次；將EP管插入磁分離架上吸附5 min，吸棄上清液；PBS洗滌3次；加DAPI染色液30 μL、hMAM-FITC染色液10 μL、CD45-PE染色液10 μL混勻避光染色15 min；PBS洗滌3次；向EP管中加入30 μL 去離子水重懸，均勻涂于防脫載玻片，待液滴干后熒光顯微鏡下觀察計數。

2. EpCAM免疫脂質磁球與納米磁球的對比試驗將計數后的1 000個MCF-7細胞分別放入7.5 mL PBS中，分別加入30 μL納米磁球和EpCAM免疫脂質磁球，混勻后進行磁分離。經DAPI染色后制作細胞涂片，在熒光顯微鏡下觀察并計數，計算磁球對MCF-7細胞的捕獲效率。將制備的細胞涂片進行hMAM-FITC抗體染色，染色后采用激光共聚焦顯微鏡進一步觀察細胞的形態大小。

3. EpCAM免疫脂質磁球捕獲效率及hMAM-FITC染色效果檢測取3只離心管，分別加入7.5 mL PBS，再分別加入10 000個MCF-7細胞和EpCAM免疫脂質磁球30 μL，混勻。作用20 min后以1 000×g離心10 min。小心將上清移入EP管中，置磁分離架上10 min后用PBS清洗3次。將EP管自磁分離架上取下分別標記為1號、2號、3號。1號不染色(對照組)，2號加入10 μL hMAM-FITC染色液，3號加20 μL hMAM-FITC染色液，室溫避光染色15 min。染色結束后磁分離，用PBS洗3次，每次2 min。用BD FACSEALIBUR流式細胞儀分析MCF-7細胞熒光信息并統計細胞個數。

4.體外模擬循環腫瘤細胞的捕獲實驗按乳腺癌CTC分離鑒定步驟進行MCF-7細胞的磁分離操作，制作涂片，于熒光顯微鏡下觀察計數。在7.5 mL健康供者的新鮮血樣中分別加入10、40、80、150、200個MCF-7細胞，加入20 μL磁球后在強生CellsearchTM系統上進行分離鑒定，比較EpCAM免疫脂質磁球與強生磁球對MCF-7細胞的捕獲效率。

5.CTC捕獲與鑒定的臨床應用為對比臨床試驗中自制EpCAM免疫脂質磁球與強生磁球的捕獲效率的差異，將乳腺癌患者血樣等分，每份7.5 mL，分別用EpCAM免疫脂質磁球和強生磁球在強生CellsearchTM系統上進行臨床樣本分析。同時按乳腺癌CTC分離鑒定步驟檢測多例乳腺癌患者樣本，并與其臨床其它檢查指標綜合分析，為臨床醫生判斷治療效果提供依據。

結果

一、EpCAM修飾后免疫脂質磁球粒徑變化

納米磁球在未經EpCAM抗體修飾前的平均粒徑為(143.7±0.5)nm[見圖1(a)]，經EpCAM抗體修飾后的免疫脂質磁球平均粒徑為(192.1 ±0.7)nm[見圖1(b)]。較小的粒徑有助于抗體磁球保持在水相溶液中的穩定性，本研究制備的抗體磁球滿足預期要求。

注：(a)未經EpCAM抗體修飾的磁球粒徑分布；(b)經EpCAM抗體修飾后的磁球粒徑分布 圖1　磁球粒徑分布

二、EpCAM免疫脂質磁球與納米磁球對比試驗

在熒光顯微鏡下比較納米磁球和EpCAM免疫脂質磁球對MCF-7細胞的捕獲能力。結果顯示EpCAM免疫脂質磁球的細胞捕獲能力明顯強于沒有抗體修飾的納米磁球，見圖2。

注：(a)未修飾納米磁球的粒徑分布；(b)EpCAM免疫脂質磁球修飾粒徑分布 圖2　納米磁球和EpCAM免疫脂質磁球捕獲MCF-7細胞能力對比

在激光共聚焦顯微鏡下，EpCAM免疫脂質磁球捕獲的細胞因與hMAM-FITC結合發出綠色熒光；納米磁球捕獲的細胞不顯示綠色熒光，提示所捕獲細胞可能為非特異性結合的血液細胞。見圖3。EpCAM抗體修飾可顯著增強磁球捕獲MCF-7細胞的效率和特異性。

注： WF為白場(white field)；Merge為DAPI及FITC-hMAM的疊加 圖3　納米磁球和EpCAM免疫脂質磁球捕獲MCF-7細胞的激光共聚焦顯微鏡分析

三、EpCAM免疫脂質磁球捕獲效率檢測

BD FACSEALIBUR流式細胞儀分析的10 000個細胞中大約有7 790～8 010個細胞為MCF-7細胞。對照組(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色組和20 μL hMAM-FITC染色組的MCF-7細胞捕獲率較為接近，均值為79%。見圖4。

圖5(a)～圖5(c)顯示了對照組(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色組和20 μL hMAM-FITC染色組框選的細胞的熒光值相對強度。對照組MCF-7細胞的背景熒光強度中位數為2.92[見圖5(e)]；采用hMAM-FITC染色的2個組隨著抗體用量的增加，熒光強度(中位數)分別升高5.8倍和12.4倍[見圖5(e)]。表明hMAM-FITC的用量可影響MCF-7細胞的染色效果。

注：(a)對照組(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色組；(c)20 μL hMAM-FITC染色組 圖4　EpCAM免疫脂質磁球捕獲MCF-7細胞的流式細胞術分析

注：(a)對照組(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色組；(c)20 μL hMAM-FITC染色組；(d)熒光信號強度比較；(e)熒光信號分析 圖5　EpCAM免疫脂質磁球捕獲MCF-7細胞的流式熒光信號分析

四、模擬研究循環腫瘤細胞捕獲與鑒定

EpCAM免疫脂質磁球在檢出的細胞形態、染色狀況接近于強生磁球檢出的細胞，見圖6(a)。模擬實驗顯示EpCAM免疫脂質磁球對10、20、40、80、150、200個MCF-7細胞的捕獲結果與強生磁球接近，見圖6(b)。EpCAM免疫脂質磁球具有較為理想的乳腺癌細胞捕獲能力。

五、臨床研究循環腫瘤細胞捕獲與鑒定

強生CellsearchTM系統的臨床檢測結果見圖7(a)，對臨床血樣的捕獲CTC成像結果顯示EpCAM免疫脂質磁球與強生磁球近似。對3例乳腺癌患者血樣的檢測結果見圖7(b)A1～A3。

注：(a)細胞形態比較；(b)細胞數量統計 圖6　EpCAM免疫脂質磁球與強生磁球捕獲MCF-7細胞總數的對比

注：(a)強生磁球和EpCAM免疫脂質磁球捕獲的臨床血液樣品中CTC的形態；(b)強生磁球和EpCAM免疫脂質磁球對臨床血液樣本的檢查結果，A1～A3為乳腺癌患者，B1～B6為疑似乳腺癌患者，C1～C3為健康女性 圖7　強生磁球與EpCAM免疫脂質磁球捕獲臨床血樣中CTC的對比

EpCAM免疫脂質磁球對1、2號患者的CTC檢出量明顯高于強生磁球，對3號患者的檢出量也高于強生磁球。EpCAM免疫脂質磁球對6例疑似乳腺癌患者和3名健康女性血液進行CTC檢測的結果見圖7(b)B1～B6、C1～C3，其中3名健康女性的CTC檢測結果分別為0、0、1個，說明EpCAM免疫脂質磁球具有較低的假陽性率；6例疑似乳腺癌患者的CTC檢測結果分別為0、2、8、28、121、93個。EpCAM免疫脂質磁球具有較高的CTC檢出率和較低的假陽性率。

采用EpCAM免疫脂質磁球構建乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒，手工操作捕獲乳腺癌患者血液中的CTC并在熒光顯微鏡下觀察。乳腺癌CTC被hMAM-FITC抗體染色顯綠色，同時DAPI染色為藍色熒光，CD45染色不顯示熒光，綜合判斷為乳腺癌陽性細胞。見圖8。

注：放大倍數為×400 圖8　EpCAM免疫脂質磁球捕獲乳腺癌臨床血樣中CTC的免疫熒光觀察

討論

癌癥患者血液中存在CTC最早報道于1869年。癌癥早期階段CTC的數量是非常少的，每1 mL血液中CTC數量一般低于100個，正常血液細胞的數量一般多于109個[13]。近年來，探測、分離多個器官來源的CTC的方法不斷發展，使CTC的連續檢測成為可能。微流控芯片技術增強了血液中的CTC與基質固定的抗體之間的結合效率。當前檢測CTC的技術主要包括基于免疫磁分離技術捕獲血液中的CTC、基于癌細胞遠大于正常血液細胞而設計的微芯片分離技術等方法[14-19]。

當前多數免疫磁球法常以EpCAM抗體的磁球來捕獲富集CTC。hMAM是WATSON等1996年首次在乳腺癌組織中發現的，只在乳腺上皮細胞中表達，并在乳腺癌細胞中過表達。hMAMmRNA 在乳腺癌患者的外周血、骨髓、胸腔積液中的陽性表達提示乳腺癌的轉移和不良預后。因此，hMAM可作為一種潛在的采用血液學方法檢測乳腺癌患者CTC的標志物。

本研究構建的基于EpCAM免疫脂質磁球和hMAM的CTC分離鑒定試劑盒對乳腺癌患者血液中的CTC具有較高的捕獲效率，手工操作能有效俘獲乳腺癌患者血液中的CTC，染色效果清晰可辨識。但該方法對乳腺癌早期診斷、術前、術后分析及治療效果評估需進行更大樣本量的研究證實。

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(本文編輯：龔曉霖)