多態性微衛星標記技術與重復序列PCR在近平滑念珠菌基因分型中的比較

多態性微衛星標記技術與重復序列PCR在近平滑念珠菌基因分型中的比較

李貞，董丹鳳，章黎華，江岑，彭奕冰

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025)

摘要：目的比較多態性微衛星標記(PMM)技術與重復序列聚合酶鏈反應(PCR)在近平滑念珠菌基因分型中的應用。方法收集2012年3月至2013年11月間上海5家醫院臨床分離的近平滑念珠菌55株，經內轉錄間隔區序列分析(ITS)進一步鑒定菌種，共有狹義近平滑念珠菌43株，之后采用重復序列PCR和PMM技術進行基因分型，比較2種分型方法的結果和效率。結果43株狹義近平滑念珠菌經重復序列PCR分型只有1種基因型；經PMM技術分型有22種基因型，以Ⅰ型(10株)、Ⅱ型(6株)為主，Ⅲ～Ⅶ型見于2或3株菌，其余15種基因型均只有1株菌。結論PMM技術用于狹義近平滑念珠菌的基因分型，分辨率高、重復性好，適用于狹義近平滑念珠菌基因組微進化的監測，而重復序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

關鍵詞：近平滑念珠菌；基因分型；多態性微衛星標記技術；重復序列聚合酶鏈反應

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-1017-04R379.4

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.013

Abstract:ObjectiveTo evaluate the application of polymorphic microsatellite marker(PMM)technology and repetitive sequence-based polymerase chain reaction (PCR) for genotyping of Candida parapsilosis. MethodsFrom March 2012 to November 2013, 55 Candida parapsilosis isolates were collected from 5 hospitals in Shanghai, which were further identified as Candida parapsilosis sensu stricto (43 isolates) by amplifying and sequencing with internal transcribed sequence(ITS). All the isolates were genotyped by repetitive sequence-based PCR and PMM technology. Finally, the results and efficacy of these 2 genotyping methods were compared. ResultsThe 43 Candida parapsilosis sensu stricto isolates had only 1 genotype by repetitive sequence-based PCR. PMM technology generated 22 genotypes. The major genotypes were Type Ⅰ (10 isolates) and Type Ⅱ (6 isolates), whereas Type Ⅲ-Ⅶ were observed in 2 or 3 isolates. Another 15 genotypes were observed in only 1 isolate. ConclusionsPMM technology is an effective genotyping method for Candida parapsilosis sensu stricto with high resolution and repeatability, which could be used to determine the micro-evolutionary variations. However, repetitive sequence-based PCR is not suitable for the genotyping of Candida parapsilosis sensu stricto.

基金項目：國家自然基金面上項目(81371873)；國家自然基金資助項目(81301462)

作者簡介：李貞，女，1988年生，碩士，主要從事真菌流行致病及耐藥機制研究。

通訊作者：彭奕冰，聯系電話：021-64370045 。

收稿日期：(2015-01-12)

Comparison on genotyping ofCandidaparapsilosisby polymorphic microsatellite marker technology and repetitive sequence-based PCRLIZhen,DONGDanfeng,ZHANGLihua,JIANGCen,PENGYibing.(DepartmentofClinicalLaboratory,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China)

Key words:Candidaparapsilosis; Genotype; Polymorphic microsatellite marker technology; Repetitive sequence-based polymerase chain reaction

念珠菌是引起醫院血流感染的重要病原體之一，嚴重威脅著患者的生命健康。近年來歐洲、拉丁美洲和亞洲一些國家的報道顯示，近平滑念珠菌已經成為引發念珠菌血癥的第2種常見病原體，發生率僅次于白念珠菌[1-2]，因而其越來越受到人們的關注。

材料和方法

一、菌株來源

收集2012年3月至2013年11月間上海5家醫院臨床分離的近平滑念珠菌55株，經內轉錄間隔區序列分析(internal transcribed sequence，ITS)進一步鑒定為狹義近平滑念珠菌43株 、Candidaorthopsilosis7株 、Candidametapsilosis5株。其中上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院的狹義近平滑念珠菌 、Candidaorthopsilosis和Candidametapsilosis菌株分別為34株、7株和3株；復旦大學中山醫院的狹義近平滑念珠菌、Candidametapsilosis各1株，上海交通大學醫學院附屬新華醫院的狹義近平滑念珠菌、Candidametapsilosis分別為3株和1株，復旦大學華山醫院的狹義近平滑念珠菌 4株，上海交通大學醫學院附屬兒童醫學中心的狹義近平滑念珠菌 1株。

二、儀器與試劑

API微生物鑒定系統(法國生物梅里埃公司)，PCR擴增儀(PTC-100 Thermal Cycle，美國MJ Research公司)，ITS、重復序列PCR及PMM技術所用引物均由Invitrogen上海技術服務部合成，PCR反應試劑盒購自日本Takara公司，Lyticase(溶壁酶)購自美國Sigma公司，電泳成像系統為Tanon 4100成像系統。

三、菌株鑒定

首先根據菌株的菌落形態及生化特性進行初步鑒定，即樣本接種于科瑪嘉顯色平板，35 ℃培養48 h，白色或淡粉色菌落通過API 20C AUX酵母菌鑒定板條進行鑒定，如鑒定結果為近平滑念珠菌則轉于20%甘油培養液中，-80 ℃凍存。提取菌株DNA，PCR擴增ITS片段,測序鑒定狹義近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis。

四、DNA提取

參照文獻[5]記載的方法提取DNA，保存于-20 ℃。

五、ITS鑒定

采用TAVANTI 等[4]推薦的方法，引物ITS1為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′,ITS4 5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′,PCR反應體系為50 μL,包括10× PCR緩沖液(無Mg2+)5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL ,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L引物各1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。擴增程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物委托Invitrogen公司測序。

六、PMM技術

參考文獻選擇[3]報道的分辨率較高的微衛星位點CP6，其重復片段為(AAC)48，片段大小約300 bp,引物序列FWD為5′-CAGGAACAG-GACAATGGTGA-3′，REV為5′-TCTGGAGCCTCT-AGGACGTTT-3′，該引物采用FAM熒光素標記。反應體系為50 μL，包括10×LaTaq緩沖液(含Mg`(2+))5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，TaKaRa LaTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。擴增程序為：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共30個循環；72 ℃ 7 min。之后PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，摸索擴增條件使PCR產物為單一條帶，擴增產物送Invitrogen公司采用高分辨率毛細管電泳判讀結果。

七、重復序列PCR

采用REDKAR等[5]推薦的方法，所用引物為Ca21(5′-CATCTGTGGTGGAAAGTAAAC-3′)、Ca22(5′-ATAATGCTCAAAGGTGGTAAG-3′)、Com21(5′-GCCGTTTTGGCCATAGTTAAG-3′)。PCR反應體系為25 μL,包括10×ExTaq緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物各1 μL，TaKaRa ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。分別將3個引物兩兩組合或自身組合進行PCR，選取最合適的引物對。擴增程序為：94 ℃ 2 min，92 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，70 ℃ 90 s，共35個循環；70 ℃ 3 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分型，Tanon 4100成像系統成像。

結果

一、狹義近平滑念珠菌分型

5家醫院的43株狹義近平滑念珠菌PMM技術共分為22種基因型，其中15種基因型均只出現過1次，即只有1株菌為該基因型。另外7種基因型多次出現，依次記為Ⅰ～Ⅶ型，見表1。其中Ⅰ型最為常見，共10株，其菌株來自于3家醫院(瑞金醫院8株、華山醫院1株、上海兒童醫學中心1株)的8例不同患者，其中有2例患者均于不同時期的痰液樣本中分離到2株菌株，這8例患者分布在6個不同的病區；有6株狹義近平滑念珠菌屬于基因型Ⅱ，均來自于同一家醫院；基因型Ⅲ～Ⅴ出現于2或3株不同患者的菌株；基因型Ⅵ、Ⅶ見于各有2株菌來自同一例患者不同時期的痰液樣本。

重復序列PCR分型結果顯示，將引物Ca21、Ca22、Com21兩兩組合或自身組合進行PCR，其中用引物對Ca21-Ca22、Ca21-Com21、Ca21-Ca21、Ca22-Ca22 及Com21-Com21擴增出的條帶數目較少或模糊不易分辨，而用Ca22-Com21引物對擴增出的條帶數目多且清晰，所以選用此對引物進行擴增分型。根據PCR產物電泳圖譜，43株狹義近平滑念珠菌均為同一種基因型，記為基因型A。見圖1、表1 。

在CPIKN中，將協同成員節點pi的點權權重作為其重要程度的衡量指標。然后，定義協同成員節點pi重要程度排序序號為xi，協同成員節點pi的重要程度信息獲取狀態為εi，若協同成員節點pi的重要程度信息已知，則εi=1，反之εi=0。

表1　狹義近平滑念珠菌的分型結果

注:M1～M5 為Candidametapsilosis菌株，M1、M4為C型，M2、M5為D型，M3為E型；O1～O3為Candidaorthopsilosis菌株，均為B型；P1～P4為狹義近平滑念珠菌菌株，均為A型
圖1狹義近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis的重復序列PCR產物電泳圖

二、相關菌種 Candida orthopsilosis、 Candida metapsilosis分型

經ITS鑒定，臨床分離診斷的55株近平滑念珠菌中Candidaorthopsilosis7株、Candidametapsilosis5株。分別用PMM技術和重復序列PCR對Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis進行分型，以觀測這2種分型方法對狹義近平滑念珠菌以外的相關菌種的區分能力。7株Candidaorthopsilosis經PMM技術分型為同一種基因型，記為Ⅷ型，見表2；經重復序列PCR分型也只有1種基因型，見圖1。5株Candidametapsilosis經PMM技術分型，有3株未擴增出有效產物，1株分型結果為240/240，另外1株分型為232/272，見表2；5株Candidametapsilosis有3種重復序列PCR基因型別，分別記為基因型C(2株)、D(2株)、E(1株)。見圖1。

表2　 Candida orthopsilosis、 Candida metapsilosis的分型結果

討論

目前一些分型方法已經被用于近平滑念珠菌家系的分型研究，如多位點序列分析(multilocus sequence typing，MLST)[6]、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)[3，6]、隨機擴增多態性DNA (random amplified polymorphic DNA，RAPD)[3，7]。VAN ASBECK等[6]和 SABINO等[3]的研究表明，狹義近平滑念珠菌由于其核甘酸序列變異度低，不能用RAPD、RFLP和MLST做進一步亞型分析，但Candidaorthopsilosis可以用RFLP、MLST區分亞型，Candidametapsilosis因為收集到的菌株數目較少，還有待進一步研究。

PMM技術是一種基于微衛星位點的分型方法，對基因序列變異度低的菌株有一定的區分能力[8]，因為微衛星位點是廣泛存在于真菌基因組中2～10 bp的短串聯重復DNA序列,具有高度的多態性。PMM技術是用熒光素標記的引物進行PCR擴增，之后用高分辨率的毛細管電泳精確地檢測擴增片段大小的分型方法[3, 8-9]。LASKER等[8]研究的42株狹義近平滑念珠菌有30種PMM基因型，分辨率達0.971。本研究中的43株狹義近平滑念珠菌有22種PMM基因型，而只有1種重復序列PCR基因型。PMM技術可以用于狹義近平滑念珠菌的亞型分析，而且分辨率較高，另外PMM技術結合熒光引物應用高分辨率的毛細管電泳儀測定擴增片段大小來判定結果，避免了凝膠電泳條帶分型的主觀誤差，重復性好。LASKER等[8]研究的42株狹義近平滑念珠菌有30種PMM基因型，但本研究中的43株狹義近平滑念珠菌只有22種PMM基因型，產生這一現象的原因可能是本研究收集的菌株中，PMM Ⅵ型、Ⅶ型各有2株菌來自同一患者不同時期的痰液樣本，而同一患者來源的樣本為同一種PMM基因型；另外不同地域來源的菌株其流行分布可能有一定的地域差異。

重復序列PCR則基于真菌基因組中的重復序列，通過比對PCR產物的電泳條帶，揭示基因組間的差異。該技術自1996年由VERSALOVIC提出后，相繼被應用于白念珠菌、熱帶念珠菌及光滑念珠菌的基因分型。就熱帶念珠菌和光滑念珠菌而言，重復序列PCR與MLST有相同的分辨率，方便快捷，可作為實驗室熱帶念珠菌和光滑念珠菌基因分型的首選方法[10-12]。但本研究中43株狹義近平滑念珠菌經重復序列PCR分型，只有1種基因型，重復序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

近平滑念珠菌家系中的相關菌株Candidametapsilosis(5株)，經PMM技術分型有3株無擴增產物；經重復序列PCR分型有3種基因型，重復序列PCR對Candidametapsilosis有一定的區分能力。7株Candidaorthopsilosis經PMM技術、重復序列PCR分型均只有1種基因型，但由于菌株數量少，且7株菌中的6株來自同一患者，所以PMM技術、重復序列PCR對Candidaorthopsilosis的分型能力還有待進一步研究。

上海5家醫院的43株狹義近平滑念珠菌經PMM技術分為22種基因型，其中Ⅰ型最為常見，共10株，其菌株來自于上海3家醫院的8例不同患者，瑞金醫院8株(8/34)，華山醫院1株(1/4)，上海兒童醫學中心1株(1/1)，這一結果表明在瑞金醫院 Ⅰ 型狹義近平滑念珠菌是相對較為流行的菌株型別，而上海其它醫院來源的狹義近平滑念珠菌菌株數目較少，要確定基因型Ⅰ是否是上海地區的流行菌株，還需要更多數量的菌株進一步驗證。

綜上所述，PMM技術用于狹義近平滑念珠菌的基因分型，分辨率高、重復性好，適用于狹義近平滑念珠菌基因組微進化的監測；而重復序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

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(本文編輯：姜敏)