乳清粉對斷奶實驗兔腸道微生物區系和益生菌的影響

呂建敏，劉月環

(1. 浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州　310053；2. 浙江省醫學科學院，杭州　310013)

乳清粉對斷奶實驗兔腸道微生物區系和益生菌的影響

呂建敏1，劉月環2

(1. 浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州310053；2. 浙江省醫學科學院，杭州310013)

【摘要】目的利用分子生物學技術研究飼糧中添加乳清粉對斷奶早期實驗兔腸道微生物區系和益生菌的影響。方法采用單因子實驗設計，選擇40日齡斷奶實驗兔，隨機分為4組(每組12只)，分別飼以乳清粉添加水平為0%、2%、5%和10%的飼糧。飼喂30 d 后，每組隨機取8只兔，麻醉處死，取盲腸內容物提取細菌總DNA，首先利用PCR-DGGE技術分析兔盲腸微生物區系多樣性，進而應用實時熒光定量PCR(SYBR Green I)法定量檢測盲腸細菌中雙歧桿菌和乳酸桿菌含量。結果(1)實驗兔盲腸細菌DGGE各分析參數隨乳清粉添加量的提高逐漸上升， 添加不同水平乳清粉均可顯著增加DGGE條帶數(P<0.05，P<0.01)。2%和5%乳清粉添加水平組的DGGE條帶數和香農指數均極顯著(P<0.01)高于未添加組，但以上2項指標在乳清粉各添加水平間差異無顯著性(P>0.05)。DGGE均勻度指數在各實驗組間均無差異顯著性(P>0.05)。(2)飼糧中添加乳清粉可提高實驗兔盲腸內容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數量，其中各乳清粉處理組(2%，5%和10%)的乳酸桿菌數量均顯著高于0%添加組(P<0.05)，10%乳清粉添加組的雙歧桿菌數量顯著高于未添加組(P<0.05)，但與其他2個乳清粉添加組無差異顯著性(P>0.05)。結論(1)飼糧中添加乳清粉可顯著提高實驗兔盲腸細菌菌群的多樣性。(2)在實驗兔飼糧中添加乳清粉可有效增加腸道益生菌數量。

【關鍵詞】實驗兔；乳清粉；PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)；實時熒光定量PCR；雙歧桿菌；乳酸桿菌

乳清粉是乳品在加工乳酪過程中產生的副產品，具有豐富的營養成分，不僅含有大量的乳糖、乳清蛋白，而且還有B族維生素和鈣、磷等多種礦物質。許多研究顯示，乳清粉具有促進幼年動物腸道發育、控制腹瀉以及增強免疫功能和抗氧化等作用[1-5]。目前，斷奶幼兔由腹瀉導致死亡問題是困擾實驗兔產業化發展的瓶頸之一，幼兔腹瀉的主要原因是其腸道消化機能不完善，極易受飼料和環境的影響產生腸道菌群失衡[6]。用抗生素治療腹瀉效果不勝理想，且國家標準明確規定[7]，實驗動物飼料中禁止添加抗生素，因此，迫切需要尋找一種安全、天然、可防治幼兔腹瀉飼料原料。我們前期研究發現，在日糧中添加5%乳清粉可使斷奶實驗兔的腹瀉率由2.38%降至0%，死亡率由20%降至0%，說明乳清粉對降低實驗兔的腹瀉率和死亡率效果顯著[8]。據此我們推測乳清粉對幼年動物腹瀉的防治作用可能是通過改善腸道內微生態環境來實現的，而要維持腸道的健康，不僅需要正常的腸道微生物區系結構，還要求腸道益生菌需占優勢地位[9]，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌是人和動物體內的重要益生菌[10]。為進一步驗證上述假設，有必要對斷奶實驗兔腸道微生物區系相關特征和的益生菌數量進行研究。在研究方法上，近年一種用于分析腸道細菌16S rRNA的分子指紋技術——變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術已廣泛用于微生物的區系結構和分類的研究，它的優點是避免了傳統微生物方法學在研究過程中容易產生的種群丟失、種群結構不清、獲得菌群數量不足等局限性，可以直接、可靠地反映微生物的多樣性情況[11，12]。 而與傳統菌群培養鑒定、計數方法相比，目前廣泛應用的實時熒光定量PCR 方法具有操作簡便，靈敏性、特異性高，污染小，計數精確等優點[9,13，14]。本實驗采用PCR-DGGE和實時熒光定量等分子生物學技術，對幼兔盲腸內容物標本進行微生物區系分析和雙歧桿菌與乳酸桿菌計數，以期較深入闡明乳清粉對實驗兔腸道微生態的作用機制，為合理開發乳清粉特色產品提供理論依據。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

普通級日本大耳白兔48只，雌雄各半，40日齡(剛斷奶)，體質量為1.0～1.2 kg，按所采食飼糧中乳清粉含量不同隨機分為A、B、C、D共4組(即A～D組試兔分別采食乳清粉添加水平為0%，2%，5%和10%的4種飼糧)。實驗兔由浙江省新昌縣大市聚鎮興達兔場提供【SCXK(浙)2010-0042】(實驗動物質量合格證號：0010993)，實驗在浙江中醫藥大學動物實驗研究中普通級兔飼養室【SYXK(浙)2008-0116】中進行，環境溫度為 (22±1)℃，相對濕度為50%～70%，氨濃度≤14 mg/m3， 光照：150-200 Lx，12 h/12 h 明暗交替，噪音<50 dB。所有實驗兔單籠飼養，早、中、晚各喂1次全價營養飼料(飼料配方和營養水平參見文獻8)，自由飲水，按實驗動物使用的 3R 原則給予人道的關懷。試兔經7 d預試期適應后進行為期30 d的正式實驗。

1.2儀器與試劑

紫外分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000，由Thermo公司制造)，用于所提取DNA的濃度和純度測定。東勝龍PCR儀(北京東勝創新生物科技有限公司生產)，用于普通PCR。DGGE瓊脂糖凝膠電泳系統(美國Bio-Rad公司生產)，用于變性梯度凝膠電泳。Real-time PCR檢測系統(FX96 Real-Time PCR System，美國Bio-Rad公司生產)，用于熒光定量PCR。

飼料級乳清粉(粗蛋白含量為12%，乳糖含量為(65～70)%，購自美國Saputo公司。雙歧桿菌(植物雙歧桿菌)和乳酸桿菌(凍干乳酸菌原料菌粉)標準品分別購自拜弗德生物科技有限公司及中科嘉億生物工程公司。PCR試劑由上海華津生物技術公司生產。DGGE試劑由Sigma公司生產。細菌熒光定量PCR試劑來自于杭州欣越生物技術公司，為標記為SYBR Green I熒光染料的整套試劑。

1.3方法

1.3.1盲腸內容物標本收集與保存：在正試期第30天，分別從每個實驗組取試兔8只，麻醉處死，解剖，取盲腸內容物立即置入無菌離心管，-80℃凍存，備用。

1.3.2細菌總DNA抽提：用酚-氯仿方法提取。取0.1 g盲腸內容物，抽提細菌基因組DNA：將樣品懸浮于900 μL PBS溶液， 洗滌、離心2次棄上清液， 加入400 μL裂解液(100 mg/L蛋白酶K，10 mmol/L Tris-HCI，15 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，4 g/L SDS pH 8.0)重懸細胞，37℃保溫(12～24) h后再加450 μL平衡酚，混勻，5 000 r/min離心10 min，轉移上層水相重復酚抽提1次。再轉移上層水相，加入450 μL氯仿：戊醇(24:1)，混勻，5 000 r/min離心10 min。再轉移上層水相，加入3 mol/L乙酸鈉(pH 5.2)1/10體積和無水乙醇2.5倍體積，混勻，置-20℃ 1 h后， 10 000 r/min離心15 min。以700 mL/L乙醇洗滌2次，晾干后，加入50 μL TE，用紫外分光光度計測定，計算濃度和比值，判斷所提取DNA的濃度和純度，應用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，產物置-20℃冰箱保存備用。

1.3.3盲腸微生物區系PCR-DGGE分析：利用1.3.2從盲腸內容物中提取的細菌總DNA，進行盲腸微生物區系PCR-DGGE分析，方法如下：

1.3.3.1細菌16S rDNA V6-V8區 擴增：參照文獻[15] 進行細菌16S rDNA V6-V8區 擴增，所采用一對細菌通用引物序列為：上游引物為5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC，下游引物為5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC，PCR產物片段大小為470 bp，由上海華津生物技術公司合成。PCR反應體系和條件為同文獻[15]。PCR 反應結束按文獻[15]方法鑒定PCR產物。

1.3.3.2變性梯度凝膠電泳(DGGE):參照文獻[15]配制濃縮膠和高低濃度變性膠，用梯度混合儀制備變性梯度凝膠，點樣后進行電泳，電泳條件同文獻[15]。

1.3.3.3銀染及凝膠成像：電泳結束后，參照文獻[15]進行硝酸銀染色，用凝膠成像系統拍照。

1.3.3.4DGGE圖像分析：采用Gel-pro4.5軟件和Past軟件對電泳圖像進行處理，分析DGGE條帶數、香農指數、均勻度指數等指標。

1.3.4盲腸中益生菌數量熒光定量PCR檢測：

1.3.4.1益生菌特異性引物設計：根據GenBank中提供的16S rRNA基因序列設計2種益生菌(雙歧桿菌和乳酸桿菌屬)特異性引物(genum-specific primers)，雙歧桿菌的上游引物為gaaagccaattacggacggaag，下游引物為tgggttatacccgcctttgac，PCR產物片段大小為180 bp；乳酸桿菌的上游引物為accagtgttgggatgttcgaac，下游引物為taaccaaccgttagtggcgc，PCR產物片段大小為144 bp。以上2組引物對由上海華津生物技術公司合成。

1.3.4.2標準菌株基因組DNA抽提及引物對特異性檢測：本實驗選擇由拜弗德生物科技有限公司生產的植物雙歧桿菌(Bifido-bacteriumadolescentis)和由中科嘉億生物工程公司生產的凍干乳酸菌原料菌粉(Lactobacillisplantarum)作為標準菌株。分別稱取上述菌粉各0.1g按 1.3.2步驟進行細菌基因組 DNA 抽提， DNA樣品置-20℃保存備用。

分別取以上 2 種菌株基因組 DNA 抽提液進行常規PCR 反應，反應體系和條件同文獻[9]。應用1.1%的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 擴增產物片斷大小與預先設計的是否一致，以確定引物的特異性。

1.3.4.3擴增曲線與靈敏度檢測：將標準品按梯度稀釋法做10倍系列稀釋，使其形成107～102拷貝/μL，經Real-time PCR反應后得到模板循環數與熒光強度關系圖。

1.3.4.4標準曲線和熔解曲線制作：將雙歧桿菌和乳酸桿菌的DNA提取物經紫外分光光度計測定濃度，換算成雙歧桿菌和乳酸桿菌的拷貝數，按文獻[9]方法制作標準曲線，real-time PCR反應體系和條件同文獻[9]。反應結束按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，自動采集熒光，制作熔解曲線。

1.3.4.5幼兔盲腸內容物雙歧桿菌和乳酸桿菌含量檢測：按制備標準曲線的反應體系和條件分別對各組待測樣品的DNA抽提液進行實時熒光定量PCR反應，實驗設陰性對照和標準品對照，每個樣品做2個重復。

1.4統計學方法

實驗結果用平均數±標準差表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行差異分析和多重比較。

2結果

2.1盲腸微生物菌群DGGE分析結果

2.1.1盲腸細菌16S rDNA V6-V8 區PCR 擴增產物鑒定：由圖1(PCR產物的電泳圖譜)可見， 每個樣品均出現一條特異性的PCR產物片斷，與marker對比，該片段大小在500 bp左右，與設計所預期的一致。

圖1　盲腸細菌V6-V8 區PCR 擴增產物電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of bacterial V6-V8 PCR products from ceacal microbes

圖2　A、B、C、D組盲腸細菌區系DGGE圖譜Fig.2　DGGE profile of ceacal bacterial community in the groups A, B, C and D

各實驗組盲腸微生物菌群DGGE圖譜及DGGE參數分析結果見圖2和表1，由表1可見，隨著乳清粉添加水平提高，DGGE各分析參數都呈上升趨勢。添加乳清粉可顯著提高實驗兔盲腸菌群的DGGE條帶數和香農指數：添加乳清粉各組(B、C、D組)的DGGE條帶數均顯著高于未添乳清粉的A組(P<0.05)，且C、D組的DGGE條帶數和香農指數與A組差異極顯著(P<0.01)。添加乳清粉對盲腸菌群的DGGE均勻度指數無顯著影響(P>0.05)。以上結果說明在實驗兔飼糧中添加乳清粉可顯著提高盲腸微生物菌群的多樣性。

2.2盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌Real-time PCR 檢測結果

2.2.1Real-time PCR可靠性分析：雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光曲線、標準曲線和熔解曲線見圖3、圖4和圖5。由圖3(雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光曲線)可見不同拷貝數的模板熒光曲線均呈“S”型，且實驗所用的雙歧桿菌和乳酸桿菌引物對的擴增靈敏度均小于100 CFU/mL。圖4顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌標準曲線的擴增線性范圍為102～107，線性相關系數為0.989~0.999。圖5為陽性模板的熔解曲線，可見2種細菌的熔解曲線呈單峰，雙歧桿菌的Tm為86.9，乳酸桿菌的Tm值為83.5。

以上結果表明本實驗所建立的熒光定量PCR反應體系擴增靈敏度好，擴增產物單一，標準曲線線性相關程度高，因此具有很好的可靠性。

2.2.2樣品雙歧桿菌和乳酸桿菌含量測定結果：各實驗組幼兔盲腸內雙歧桿菌和乳酸桿菌數量見表2：隨著實驗兔飼量中乳清粉添加量的提高，幼兔盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量都呈上升趨勢，其中，B、C、D組(2%、5%和10%乳清粉添加組)的乳酸桿菌的含量均顯著(P<0.05)高于A(0%)組； D組的雙歧桿菌含量顯著高于A和B組(P<0.05)，與C組無差異顯著性(P>0.05)。

表1　盲腸微生物菌群DGGE參數分析結果

注：同行無字母或數據肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note. In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01). The same as in table 2.

圖3　雙歧桿菌與乳酸桿菌熒光曲線 Fig.3　Fluorescence curves of Bifidobacteria and Lactobacillus

圖4　雙歧桿菌(A)與乳酸桿菌(B)的標準曲線(擴增線性范圍102~107，標準曲線相關系數為0.989~0.999)Fig.4　Standard curves of the real-time fluorescence quantitative PCR of Bifidobacteria (A) and Lactobacilli (B). The linear range of amplification varied between 102 -107 genomes, depending on the genome size of the target species. Standard curves had correlation coefficient values between 0.989-0.999)

圖5　雙歧桿菌和乳酸桿菌的熔解曲線Fig.5　Dissociation curves of amplification products ofBifidobacteria and Lactobacillus

3討論

腸道微生態環境對動物腸道甚至整個機體的健康起著重要作用，因此如何選擇一種快速、準確、簡便的腸道微生物研究方法對深入研究腸道微生態就顯得尤為必要。傳統細菌培養、計數方法費時費力，還存在容易引起種群丟失、種群結構不清等弊病，并且由于個別菌種難以培養，不能準確地反映腸道菌群結構和細菌數量，大大阻礙了腸道微生態研究發展。分子生物學技術的發展，為深入研究腸道菌群結構特征及細菌定量提供了便利。目前應用最廣泛的就是用于腸道微生物遺傳特性和分類研究的變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術和用于細菌定量的實時熒光定量PCR[11-14]。本實驗利用PCR-DGGE和實時熒光定量PCR等分子生物學技術研究實驗兔盲腸微生物區系的多樣性和相關益生菌數量，結果顯示：本實驗所建立的PCR-DGGE體系可準確獲得細菌16S rDNA的V6-V8區PCR產物特異性片段，并獲得了較清晰的DGGE圖譜，可順利進行各項參數的分析；實驗建立的實時熒光定量PCR反應體系也具有較高的靈敏度(擴增靈敏度小于100 CFU/mL)，可靠性(熔解曲線顯示為單峰，擴增產物單一)和準確性(利用標準菌株制備的標準曲線呈強線性相關)，類似于相關文獻報道[9,14，15]。以上結果表明本實驗所建立DGGE-PCR和實時熒光定量PCR反應體系是可行的，值得在實驗兔腸道微生物研究中推廣應用。

表2　雙歧桿菌和乳酸桿菌的實時定量結果 (log 10 N /0.05 g 盲腸內容物,

以往研究表明，乳清粉對防止幼年動物腹瀉，促進動物生長起到重要作用[1,2,8,16，17]，但對乳清粉抗腹瀉作用的機制研究還鮮有報道。本實驗較深入研究了乳清粉對實驗兔腸道微生物區系多樣性和益生菌數量消長的影響，發現斷奶實驗兔采食含一定量乳清粉飼糧1個月后，盲腸菌群的DGGE條帶數和香農指數(反映腸道微生物多樣性的指標)顯著提高，盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量也顯著增加，且DGGE條帶數、香農指數、雙歧桿菌和乳酸桿菌數量均隨乳清粉添加量的增加呈上升趨勢。該結果充分驗證了我們前期的推測，并可由此得出乳清粉抗腹瀉作用的可能的機制為：一方面，乳清粉中所含有乳糖可為腸道中乳酸菌發酵提供大量底物，不僅可促進乳酸菌的繼續增殖，而且乳酸菌發酵所產生的乳酸可促使腸道pH下降，能促進其他益生菌增殖，提高菌群結構的多樣性，抑制有害菌生長；另一方面，乳清粉中含有多種乳蛋白(乳鐵蛋白、免疫球蛋白、支鏈氨基酸等)，具有抗氧化、增強免疫等生物活性作用[5]，對于維持腸道正常菌群結構，提高菌群多樣性起到積極作用。本研究充分驗證了乳清粉具有改善腸道微生態環境，促進益生菌增殖的作用，為乳清粉作為一種抗腹瀉的天然飼料原料應用于實驗兔飼養中提供了科學依據。

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〔修回日期〕2015-06-28

研究報告

Effects of dried whey on the intestinal bacterial community and

probiotics in weaned laboratory rabbits

LV Jian-min1，LIU Yue-huan2

(1. Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China；

2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)

【Abstract】Objective To investigate the effects of dried whey on the intestinal bacterial community and probiotics in weaned laboratory rabbits. Methods A single factor design was employed to investigate the effects of dried whey supplemented at levels of 0%, 2%, 5% and 10%, respectively, on 48 weaned (40-day-old) laboratory rabbits. At the day 30, eight rabbits in each group were taken and sacrificed after anesthesia. The total bacterial DNA from the ceacal content of each selected rabbit was drew to analyze the bacterial community and intestinal probiotics (Bifidobacterium and Lactobacillius) population by PCR-DGGE and real-time fluorescence quantitative PCR, respectively. Results1) The DGGE parameters of ceacal bacterial community were increased with the increasing dried whey supplemental levels. The number of DGGE band in 2%, 5% and 10% dried whey supplement groups (P<0.05, P<0.01), the Shannon index in 5% and 10% supplement groups (P<0.01) were significantly higher than that in the 0% supplement group, but the indices of DGGE band and Shannon index had no significant differences among the 2%, 5% and 10% dried whey supplement groups (P>0.05). Supplying dried whey has no significant effects on the homogeneity index (P>0.05). 2) The population of Bifidobacterium and Lactobacillius in ceacal content had a trend of increase with the rising dried whey supplement levels. Compared with the 0% supplement group, the Lactobacillius populationin the 2%, 5% and 10% supplement groups (P<0.05), the Bifidobacterium population in the 10% supplement group (P<0.05) were significantly increased. ConclusionsThe results of our study indicate that: 1) Supplying dried whey in the feed of laboratory rabbit can effectively increase the diversity of ceacal bacterial community. 2) Dried whey may effectively improve the intestinal probiotics population.

【Key words】Laboratory rabbits；Dried whey；PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); Real-time fluorescence quantitative PCR; Bifidobacterium；Lactobacillius

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.003

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0012-06

[通訊作者]劉月環(1974-)，女，副研究員，博士，研究方向：生物技術與實驗動物育種。 Email: yuehuanliu@163.com。

[作者簡介]呂建敏(1971-)，女，研究員，博士，研究方向：實驗動物營養與免疫。E-mail: ljm6666@163.com。

[基金項目]浙江省科技廳資助 (編號：2008F0003)；浙江中醫藥大學比較醫學創新團隊基金(編號：XTD201301)。