培養法和PCR法用于實驗大、小鼠細菌檢測的比較分析

馮　潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高　誠

(上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監督檢驗站，上海　201203)

培養法和PCR法用于實驗大、小鼠細菌檢測的比較分析

馮潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高誠

(上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監督檢驗站，上海201203)

【摘要】目的比較培養法和PCR法對實驗大、小鼠的細菌檢測效果。方法分別采用傳統細菌分離培養結合生化鑒定方法和PCR方法，對78只SPF級大鼠和422只SPF級小鼠進行檢測，對兩種方法的檢測結果進行比較分析。結果78只SPF級大鼠均未檢測出陽性。422只SPF級小鼠，培養法檢測陽性率7.11%(30/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。PCR法檢測陽性率7.58%(32/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。結論PCR法的敏感性高于培養法，操作簡便、快捷，適用于實驗動物細菌的快速診斷和大規模的質量篩查。

【關鍵詞】培養法；PCR法；實驗動物；細菌

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌這3種細菌均屬于條件性致病菌，廣泛分布于自然界，正常情況下不會導致人和動物的臨床癥狀和疾病發生，但在免疫功能低下、定居部位改變或失調等特定情況下可引起機體的感染。這類細菌主要通過接觸和空氣傳播，以潛伏感染為主，對于免疫系統受損的宿主，常表現為感染、炎癥甚至死亡[1-3]，對實驗動物質量以及實驗結果均造成影響。我國實驗動物微生物等級及監測標準GB/T14922.2-2011明確規定，無特定病原體級(specific pathogen free，SPF)實驗大、小鼠必須檢測和排除上述3個項目。近年來文獻報道關于實驗動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等條件性致病菌的陽性率屢見不鮮[4-6]。國標推薦的檢測方法為經典的分離培養法，也是微生物診斷的金標準。但鑒于培養法存在耗時費力、操作繁瑣、結果受檢測人員主觀判定干擾較大等多方面原因，本實驗室嘗試建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測方法，并與國標推薦的分離培養法進行比對，以探索PCR方法作為實驗動物細菌快速檢測方法的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物：所有檢測的實驗大鼠、小鼠均為SPF級，來自上海10家實驗動物生產單位。

1.1.2菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 27853購自美國標準生物品收藏中心，肺炎克雷伯桿菌CMCC 46117購自中國醫學微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3主要試劑：血瓊脂平皿、營養肉湯、NAC培養基、革蘭氏染液、細菌生化鑒定管、瓊脂粉均購自上海伊華醫學科技有限公司，高鹽甘露醇平皿、DHL平皿均購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、2× Taq Plus Master Mix(Dye Plus)、DL2000 plus DNA marker均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖購自西班牙Bio-West公司，GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛(SBS)基因技術有限公司。

1.2方法

1.2.1培養法檢測：按國家標準GB/T14926-2001《實驗動物 微生物學檢測方法(1)(2)》進行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌的常規分離培養、鑒定。無菌采集動物回盲部內容物，分別接種至高鹽甘露醇平皿、NAC增菌液和DHL平皿，36℃培養(24～48)h，觀察培養結果。若有可疑樣品則按國標實驗步驟繼續進行下一步純化和鑒定工作。

1.2.2DNA提取：取上述回盲部內容物0.2 g，懸浮于1 mL的PBS(pH 7.4)中，850 r/min離心5 min后取上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書嚴格操作，提取DNA模板，用于PCR檢測。獲得DNA樣品于-20℃ 保存。

1.2.3PCR法檢測：采用本單位已建立好的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR方法對樣品進行檢測[7-9]。引物序列見表1。

PCR反應體系50 μL，包括2× Taq Plus Master Mix (Dye Plus) 25 μL，其中Mg2+終濃度為2.5 mmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，引物各0.2 μmol/L。

PCR反應程序：95℃預變性5 min后，按95℃ 變性30 s，57℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s的程序循環34次，最后72℃ 延伸10 min。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。PCR陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，經凝膠電泳純化回收后進行測序，測序結果與GenBank中已知核酸序列進行BLAST。

2結果

2.1培養法檢測結果

采用培養法對422只SPF級小鼠、78只SPF級大鼠進行檢測，共檢出30只陽性動物(7.11%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。 其中有4只動物檢測結果顯示金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽性。

2.2PCR法檢測結果

對上述動物同時進行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測，共檢出32只陽性動物(7.58%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。對陽性樣品進行測序后，與GenBank發表的序列進行比對，同源性均可達98%以上。其中有5只動物金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽性。

2.3培養法與PCR法檢測結果比較

被檢動物的品系和檢測結果詳情見表2。培養法檢測出陽性樣品30只，PCR法檢測出陽性樣品32只。培養法分別檢測金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌22只、肺炎克雷伯桿菌2只；PCR方法分別檢測金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌25只、肺炎克雷伯桿菌2只。其中有1例金黃色葡萄球菌和3例綠膿桿菌經培養法檢測為陰性，但PCR檢測為陽性。有1例經培養法檢測金黃色葡萄球菌為陽性，但PCR法未能檢出。

表1　PCR引物列表

表2　被檢動物品系及檢測結果統計

3討論

實驗動物細菌質量控制是評價動物質量好壞的重要指標之一。細菌感染對實驗動物本身的生長發育、實驗動物的生產使用、科學研究的結果以及從業人員和環境均能造成不同程度的影響。因此，開發新型檢測手段無論從實驗動物質量控制還是從生物安全的角度都顯得尤為必要。

目前細菌檢測的方法一般包括分離培養、血清學檢測抗體、抗原以及核酸檢測方法等[10,11]。細菌分離培養被認為是金標準，也是最為常用的方法。我國實驗動物國標推薦的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌檢測，采用的就是分離培養法。該方法根據細菌生物學特性、表型特征進行鑒定，經典、準確，但存在操作繁瑣、實驗周期長、效率較低等缺陷，受檢測試劑、檢測程序、軟硬件等多因素限制，易造成檢測結果的偏離。分子生物學技術則是針對細菌的特異性DNA進行檢測，因具有敏感、快速、簡便等優點已被廣泛應用，我國實驗動物科研工作者已陸續開發了多種病原體的分子生物學檢測技術[12,13]。多重PCR是以普通PCR為基礎，同時加入多對引物，同時擴增多個目的基因，從而達到快速高效的一種新型手段[14-16]。但PCR方法也存在易污染、易出現假陽性、產物需經測序驗證等缺點，實際應用中應加以規避。

本研究針對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌同時開展了培養法和PCR法檢測。通過比較發現，PCR法檢出率略高于培養法，在實際操作過程中采用國標推薦的分離培養法，全程至少需要3～7 d時間，而PCR法僅需1 d時間即可完成。因此PCR方法在效率和敏感性上都具有較大優勢，適合用于實驗動物細菌感染的快速診斷和大規模的質量篩查。但值得注意的是，PCR產物易造成對實驗環境的污染，導致假陽性的出現，因此在操作過程中應盡量避免。

理論上講培養法檢測呈陽性的樣品，PCR法檢測應均能檢出。但本研究中有1例樣品經培養法檢測金黃色葡萄球菌為陽性，但PCR法檢測為陰性。這一現象在其他類似文獻報道中也出現過[17]，我們認為原因可能是樣品DNA提取失敗，以后的PCR檢測過程中可考慮加入質控引物，以評估被檢樣品的DNA模板質量是否合格。

綜上，分離培養法和PCR法均能用于實驗動物的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌檢測，應將兩者結合，以達到準確、高效的目的。對少量樣品進行感染診斷，采用分離培養法較為合適。當出現動物疫情爆發需要快速診斷或進行流行病學調查時可采用PCR結合測序法進行篩查。

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〔修回日期〕2015-06-17

研究報告

Comparison of culture and PCR assays for detection of

bacteria in laboratory rats and mice

FENG Jie, XIE Jian-yun, FENG Li-ping, WEI Xiao-feng, GAO Cheng

(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai Quality Monitoring Center of

Laboratory Animals, Shanghai 201203, China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the efficiency of bacteria culture and PCR assays for detection of Staphylococcusaureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) in laboratory rats and mice. Methods Bacteria culture combined with biochemical identification and PCR assay were used to detect 78 SPF rats and 422 SPF mice and the results of the two methods were compared. Results All the 78 rats were negative. Of the 422 mice, the positive rate by culture was 7.11% (30/422), of which, 10 were S. aureus, 22 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae. The positive rate by PCR was 7.58% (32/422), of which, 10 were S. aureus, 25 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae.ConclusionsThe high sensitivity, rapid procedure and easy to operate of PCR assay makes it valuable for rapid bacteria diagnosis and large-scale screening in laboratory animals.

【Key words】Culture; PCR; Laboratory animals; Bacteria; Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) Rats; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.005

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0023-04

[作者簡介]馮潔(1981-)，女，碩士，副研究員，研究方向：實驗動物質量控制，E-mail： moyifj@163.com。

[基金項目]上海市科委基金項目(12140900500、14140900600)。