軟骨細胞特殊染色技術的比較與應用

于　斐，曾　暉，于紅燕，雷　鳴，袁　昊，肖德明

(1.北京大學深圳醫院，深圳 廣東　518036；2.濱州市濱城區市立醫院，濱州 山東　256600)

軟骨細胞特殊染色技術的比較與應用

于斐1，曾暉1，于紅燕2，雷鳴1，袁昊1，肖德明1

(1.北京大學深圳醫院，深圳 廣東518036；2.濱州市濱城區市立醫院，濱州 山東256600)

【摘要】目的探討多種特殊染色技術在軟骨細胞中的染色規律及其應用價值。方法選取出生7 d內的C57BL/6J小鼠12只，處死后取雙側膝關節軟骨行軟骨細胞原代培養，并行II型膠原免疫熒光鑒定，取5代以內的原代細胞制作細胞爬片，細胞爬片制備完成后行HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色及II型膠原免疫組化染色，觀察軟骨細胞組織形態變化，并對幾種染色方式進行比較。結果HE染色中細胞核呈紫藍色，細胞質呈粉紅色，細胞形態結構清楚；番紅O-固綠雙染色中細胞核呈粉紅色，細胞質呈藍綠色，細胞形態結果較清晰；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色時，衰老軟骨細胞呈綠色，未衰老細胞無著色；II型膠原免疫組化染色時，II型膠原呈棕黃色，細胞核呈紫藍色。結論HE染色和番紅O-固綠雙染色可以清晰分辨細胞核和細胞質等細胞結構，對單個細胞形態的顯示比較清楚；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色可以顯示出衰老細胞的數量及衰老的程度；II型膠原免疫組化染色可以對II型膠原進行定位與定量。

【關鍵詞】軟骨細胞，特殊染色，細胞爬片，原代細胞，膝關節

骨關節炎發病機制及治療措施的研究中經常用到細胞學水平的研究，觀察軟骨細胞的形態結構成為實驗中的一種重要的方法。在過去的研究中[1-3]，人們對軟骨大體標本的特殊染色技術已經進行了大量的改良，并應用于骨關節炎的研究中，取得了良好的效果，但是對于軟骨細胞水平的染色技術發展緩慢，以至于無法用簡便的方法對細胞形態進行觀察，對研究造成了不便。本研究利用C57BL/6J小鼠進行軟骨細胞的原代培養，對軟骨細胞爬片進行HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β半染糖苷酶衰老染色及II型膠原免疫組化染色，探討這幾種染色技術在軟骨細胞爬片中的染色規律及應用價值，為骨關節炎細胞水平研究提供便利的條件。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及實驗環境: 出生7 d內的健康SPF級C57BL/6J小鼠12只【動物合格證號：No:44007200018611】，雌雄不限，體重(4±1) g，實驗用小鼠夠購買自廣東省醫學實驗動物中心【生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002；使用許可證號：zSYYX(粵)2013-0002】，飼養于北京大學/香港科技大學醫學中心深圳醫院實驗動物中心【使用許可證號：SYXK(粵)2010-0106】SPF級屏障區域的PVC鼠籠內，持續過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規范條例。

1.1.2實驗儀器: 高壓滅菌器(日本Hirayama公司)，用于實驗材料的滅菌；電熱鼓風干燥箱(中國精宏公司)，用于滅菌材料的干燥；純水機(美國Millipore公司)，用于試劑配制；恒溫水浴鍋(上海百典儀器設備有限公司)，用于試劑復溫；生物潔凈工作臺(中國蘇凈公司)，用于實驗操作；微量移液槍(Thermo fisher)，用于試劑配制及細胞培養；高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，用于細胞離心；培養箱(德國Themo公司)，用于細胞培養；光學顯微鏡(德國Leica公司)，用于細胞觀察及拍照。

1.1.3實驗試劑: II型膠原一抗、goat anti-rabbit IgG H&L (Cy3 ?) preadsorbed 9購自Abcam公司，生物素化兔抗山羊IgG、SABC-POD、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，fast green solution、safranin O solution購自Scytek公司，細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天公司，Collagenase、胰酶購自Worthington公司，改良型RPMI-1640培養基購自HyClone公司，青/鏈霉素溶液購自伊科賽公司，胎牛血清購自Life公司，0.4%臺盼藍溶液購自廣州晶欣公司，二甲苯、無水乙醇、30% H2O2購自廣州化學試劑廠，蘇木素購自廣州速聚生物有限公司，中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司，伊紅Y購自行知生物科技有限公司。

1.1.4試劑配制: 軟骨細胞培養液：改良型RPMI-1640培養基 90 mL，胎牛血清 10 mL；4% II型膠原酶消化液：collagenase粉末 4 g, PBS 96 mL。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠膝關節軟骨細胞的分離培養: 取出生7 d以內的C57BL/6J小鼠12只，全部實驗動物氣管窒息法處死，置于75%酒精中浸泡5 min，取出小鼠用碘伏消毒膝關節處；PBS漂洗3遍各3 min；將組織塊剪切成 1 mm3；加入含有雙抗的4% II型膠原酶中于37℃、5% CO2培養箱中消化4 h；充分吹打細胞消化液，200目過濾收集濾液；1 500 r/min離心5 min，無菌PBS清洗并離心2次；棄上清液加入6 mL完全培養基重懸細胞沉淀，接種至培養瓶中；于37℃、5% CO2培養箱中培養觀察，1∶3比例傳代，取3代以內的細胞進行實驗。

1.2.2軟骨細胞爬片的制作： 準備多聚賴氨酸溶液浸泡后的24孔板大小的蓋玻片于超凈臺中晾干；5代以內的軟骨原代細胞消化后臺盼藍計數，配制成1×105/mL細胞懸液；24孔板中加入少許培養基，將細胞懸液均勻滴到玻片上；常規培養6 h等到細胞貼壁后，再滴加培養基布滿整個板底，繼續培養至24 h。

1.2.3軟骨細胞的鑒定： 將分離取得的細胞1×105接種到細胞爬片，靜止貼壁；吸去上清培養基；孵育一抗，anti-collagen II antibody，37℃，1 h；PBS輕微洗滌3次；孵育goat anti-rabbit-Cy3，37℃ 1 h；PBS輕微洗滌3次；孵育Hoechst 33258，室溫15 min。

1.2.4細胞爬片的HE染色： 4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min，流水沖洗3次各2 min，蘇木素滴染2 min, 自來水返藍2 min，80%酒精急洗，伊紅滴染30 s。

1.2.5細胞爬片的番紅O-固綠雙染色： 4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min，流水沖洗2 min ×3，蘇木素染核2 min，自來水返藍2 min，番紅O染液滴染30 min，95%乙醇分化10 s，自來水洗10 s，60℃預熱固綠滴染1 min，蒸餾水急洗一次，番紅O染液復染30 min，95% 乙醇分化5 s，自來水沖洗10 s。

1.2.6細胞爬片的SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色： ①染色工作液根據碧云天細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書配制：β-半乳糖苷酶染色液A 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液B 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液C 930 μL，X-Gal溶液50 μL，混合均勻。②β-半乳糖苷酶染色固定液固定30 min，PBS洗5 min ×3，染色工作液覆蓋爬片37℃過夜。

1.2.7細胞爬片的II型膠原免疫組化染色： 4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min，流水沖洗2 min ×3；烤片3 min；蒸餾水沖洗2次；抗原修復； PBS沖洗3次；滴加過氧化物酶阻斷劑；PBS液沖洗3次；滴加非免疫性動物血清；滴加II型膠原一抗；PBS液沖洗3次；滴加生物素標記的二抗；滴加SP溶液；滴加2滴新鮮配制的DAB溶液。

2結果

幾種特殊染色方法觀察軟骨細胞形態結構比較見表1。

2.1倒置顯微鏡下軟骨細胞形態

常規消化細胞，并用含10% FBS的1640培養基培養關節軟骨細胞，分別與0、3、7 d于顯微鏡下觀察細胞形態(圖1見彩插6)。0 d軟骨細胞均勻分布在培養瓶底，處于待貼壁狀態；3 d軟骨細胞完全貼壁，呈梭形、三角形或多角形；7 d軟骨細胞融合，鋪滿培養瓶瓶底。

2.2II型膠原免疫熒光鑒定軟骨細胞

II型膠原是軟骨細胞分泌的特異性膠原，可利用II型膠原的免疫熒光對軟骨細胞進行鑒定。熒光標記后，軟骨細胞細胞核呈圓形紫藍色熒光，II型膠原呈條帶狀紅色熒光(圖2見彩插6)。

2.3HE染色觀察軟骨細胞

蘇木素可與核酸等酸性物質結合顯示藍色，而伊紅可與堿性蛋白物質結合顯示出紅色，進而將細胞的形態結構區分開來。染色后我們可以看到軟骨細胞的細胞核呈藍色，為圓形或者卵圓形，細胞質呈粉紅色，三角形或梭形(圖3見彩插6)。

2.4番紅O-固綠雙染色觀察軟骨細胞

番紅O是堿性染料可與核酸結合顯示紅色，固綠是酸性染料可與蛋白結合將顯示藍色或者綠色。染色后我們可以看到細胞核呈粉紅色，但部分顏色被細胞質染色所覆蓋，細胞質呈藍綠色(圖4見彩插6)。

2.5SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色觀察軟骨細胞

細胞衰老后，溶酶體中β半乳糖苷酶的表達升高，表達量越高，細胞所染顏色越重，衰老程度也越嚴重。染色后我們能夠清楚的看到細胞質綠染且顏色深淺不一，細胞核無法辨別(圖5見彩插6)。

2.6II型膠原免疫組化染色觀察軟骨細胞

II型膠原免疫組化染色可以特異性的定位II型膠原的位置，蘇木素復染后可以顯示細胞核的位置。染色后我們可以看到II膠原表達出呈現棕黃色，而細胞核呈現紫色(圖6見彩插6)。

表1　幾種特殊染色方法觀察軟骨細胞形態結構比較

注：“-”為陰性，“+”為陽性且“+”至“++++”陽性程度越高，分辨越明顯。

Note. “-” is negative, “+” is positive ,“+”to“++++” represent the increasing levels of positive staining and better resolution

3討論

軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞，被包埋在軟骨基質中，它可以感受機體周圍的變化，維持細胞外基質的平衡，其分泌的細胞外基質主要是糖蛋白和II型膠原[4]。軟骨細胞的細胞核較小，呈圓形或卵圓形，有一到數個核仁，細胞可呈三角形、梭形或多角形。在軟骨組織中，越靠近周邊的軟骨細胞越幼稚，常單個分布；越靠近中央的軟骨細胞越成熟，常多個聚集在一起[5]。骨關節炎(OA)與關節軟骨細胞的衰老和凋亡密切相關，主要表現為進行性的軟骨關節破壞，本質上是一種生物學重建過程[6]。隨著我國老齡化進程的加劇，該病已經成為影響老年人健康的主要慢性退行性病變之一，但是對其發病機制仍然知之甚少，因此對該病的研究成為近年來的熱點。

目前對于動物標本的特殊染色技術發展較快，在骨關節炎領域的研究中應用廣泛。細胞學水平的研究與動物水平的研究同等重要，但是細胞染色技術發展較慢，在骨關節炎研究領域應用較少，這一方面是因為細胞染色與組織標本相比染色困難，另一方面是由于電鏡等技術的發展代替了染色對細胞結構的觀察。但是，對于軟骨細胞的特殊染色仍有其優點，比如操作簡便、價格低廉、不需要特殊的儀器設備等，這對于沒有電鏡等特殊設備的實驗室仍然是一個好的選擇。

本課題組在進行骨關節炎的研究過程中，根據研究的需要對軟骨細胞的HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β-半乳糖苷酶衰老染色和II型膠原免疫組化染色條件進行了探究，取得了良好的效果。

蘇木素-伊紅染色技術是病理技術中最經典的染色方法，是由Waldeyer于1863年首先提出來的，一直沿用至今。常規的HE染色是根據蘇木素和伊紅兩種染料對酸堿性物質的親和性不同而著色，蘇木素可與核酸等酸性物質結合，從而使細胞核呈現藍色，而伊紅可以與細胞質中的堿性蛋白物質結合，顯示出紅色，進而將細胞的形態結構區分開來[7]。我們可以看到，在軟骨細胞爬片的HE染色中，細胞核與細胞質結構清楚，單個細胞的輪廓也清晰可辨，是一種觀察細胞形態較好的染色方式。

番紅O-固綠雙染色中，番紅O是堿性染料可與核酸結合將細胞核紅染，固綠是酸性染料可與蛋白結合將細胞核染成藍色或者綠色[8]。在軟骨細胞爬片中，可以分辨出細胞核與細胞質的結構，但分辨率不如HE染色清楚，這種分辨情況與軟骨組織中兩種染色的分辨情況正好相反，這可能是由于固綠與番紅O相比更容易著色，而綠色可以覆蓋部分紅色使得結構相對不太清晰。但是，該染色在軟骨細胞或軟骨組織中是一種特異性的染色，其使用率較高，通過我們在軟骨細胞爬片上的實驗也得到了預期的效果，可以在軟骨細胞中加以應用。

β-半乳糖苷酶是檢驗細胞衰老的一種特異性的標志酶，由Dimri等[9]在1995年首次提出，衰老軟骨細胞在pH 6.0時會表現出溶酶體β-半乳糖苷酶活性的升高，衰老的軟骨細胞可以表達此酶，通過對不同階段的軟骨細胞的衰老染色情況進行分析，可以得到軟骨細胞的衰老情況，從而確定不同狀態下軟骨細胞老化的速度及程度[10]。通過實驗結果我們可以看到，由于β-半乳糖苷酶表達量的升高，細胞質被染成綠色，并且當細胞衰老程度越嚴重時，綠色越明顯，而未衰老的細胞則無此染色。該染色在反應細胞的形態結構方面不清楚，無法分辨細胞核與細胞質。

II型膠原是軟骨細胞分泌的特異性物質，通過II型膠原免疫組化染色可以對軟骨細胞進行特異性的定位，對II型膠原的分布及定量作用明顯，通過蘇木素的復染，可以分辨其余細胞，作用很大。我們通過染色發現，II型膠原表達處呈現棕黃色，而通過蘇木素的復染，細胞核呈紫色，從而清晰的分辨出細胞核與細胞質。由于II膠原只是細胞分泌的細胞外基質中的部分成份，該染色無法顯示細胞質中的其他成份，所以單個細胞的形態不是很清楚。該染色在II型膠原特異性的定位及定量作用比較明顯。

綜上所述，各種染色方法各有優缺點，但在軟骨細胞形態觀察方面，HE染色和番紅O-固綠雙染色分辨細胞比較清楚，可以獲得更加全面的信息，尤其以HE染色最佳；SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色對于衰老軟骨細胞的數量及軟骨細胞衰老程度的檢測用處較大；II型膠原免疫組化染色則可以用于II型膠原的定位與定量。我們在使用軟骨細胞進行研究時，可以綜合采用多種染色方法。

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〔修回日期〕2015-07-12

研究報告

Comparison of different special staining techniques of

chondrocytes and their application values

YU Fei1, ZENG Hui1, YU Hong-yan2, LEI Ming1, YUAN Hao1, XIAO De-ming1

(1. Peking University Shenzhen Hospital, Guangdong Shenzhen 518036, China;

2. Municipal Hospital of Binzhou, Shandong Binzhou 256600)

【Abstract】ObjectiveTo compare the advantages and values of several special staining methods of chondrocytes.MethodsTwelve 7-day old healthy C57BL/6J mice were killed to obtain the cartilage tissue of the knee joint in order to isolate the chondrycytes. Type II collagen was used to assess the chondrocytes. Then the chondrocyte climbing slices were prepared. The materials were fixed, and HE staining, Safranin O-fast green staining, SA-β-gal staining and immunohistochemical staining of Type II collagen were performed and compared. ResultsHE staining showed clear morphology of the chondrocytes. The cell nuclei were stained blue and the cytoplasm was pink. Safranin O-fast green staining showed that the nuclei were pink and the cytoplasm green. SA-β-gal staining showed that the aging cells were green while the young cells were colorless. Immunohistochemical staining of type II collagen showed the distribution of type II collagen and they were stained brown while the cell nuclei were blue.ConclusionsHE staining and safranin O-fast green staining can provide more information than the other staining techniques. SA-β-gal staining is useful in the analysis of aging chondrocytes. Immunohistochemical of type II collagen can be used to study type II collagen.

【Key words】Chondrocytes, special staining; Cell climbing slices; Primary cells; Knee joint, mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.012

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0058-04

[通訊作者]肖德明 (1956-)，男，博士生導師、教授、主任醫師。研究方向：骨關節炎、骨科生物材料。E-mail: xiaodm1@163.com。

[作者簡介]于斐 (1989-)，男，碩士研究生。研究方向：骨關節炎、骨科生物材料。E-mail: ocarfyu@163.com。

[基金項目]國家自然科學基金面上項目(項目編號：81272032)；深圳市科工貿與信息委員會重點項目(項目編號：201101001)；深圳市科創委資助項目(項目編號：JCY20130402114702130)。