miR-150對結直腸癌患者腫瘤細胞侵襲與轉移能力的影響

杜曉陽 王連濤 董功航

MicroRNAs是一段由18～24個核苷酸組成的小片段RNA，它能夠結合到靶基因上，抑制或降解靶基因，在轉錄后調控靶基因的表達。研究發現，MicroRNAs會參與到細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等生理活動中[1, 2]。近年來，隨著對miR-150等microRNAs研究的逐漸深入，越來越多的研究成果證實其可參與到腫瘤的形成、進展與對化療發生耐藥的過程中[3-5]。但是，目前miR-150在結直腸癌細胞中發揮的作用尚不明確。為了探索miR-150對結直腸癌患者腫瘤細胞侵襲與轉移能力的影響，我們采集7例結直腸癌患者的腫瘤組織樣本進行細胞培養、RNA提取及miR-150表達水平的檢測，探索過表達的miR-150對腫瘤細胞產生的影響，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中7例結直腸癌患者的樣本均采集于我院及中山大學附屬第六醫院收治的患者，結直腸癌細胞系CACO2，HCT-116，HT-29，SW620均購自中科院上海細胞生物研究所。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 TRNzol RNA提取試劑， miR-150特異引物、microRNAs RT-qPCR試劑盒、RNA酶抑制劑，micrON ? hsa-miR-150-5p mimic、micrON ? hsa-miR-NC mimic、riboFECT ? CP，Lipofectamine 2000。

1.2.2 主要儀器 PCR 擴增儀，ABI 7500 Real-Time PCR system，倒置熒光顯微鏡，細胞計數器，電子顯微鏡，BD侵襲小室。

2 主要方法及步驟

2.1 細胞培養

取適量的完全培養基重懸細胞，接種于培養皿中，在5%CO2、37℃的恒溫箱中進行培養，每兩天換液一次。在六孔板上按照適當的密度接種CACO2，HCT-116，HT-29，SW620各一孔，在細胞培養箱中進行培養，當其密度達到80%-90%時對其RNA進行消化提取。

2.2 RNA的提取及miR-150的表達檢測

2.2.1 RNA的提取 將在對7例結直腸癌患者施行手術的過程中采集的腫瘤組織標本打碎至呈勻漿狀。將氯仿（每使用1毫升的TRNzol試劑應加入0.2ml的氯仿）加入此勻漿中進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作，提取上層的上清液。將異丙醇（每使用1毫升的TRNzol試劑應加入0.5ml的異丙醇）加入到此上清液中進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作。將此上清液倒出后，將濃度為75%的酒精（每使用1毫升的TRNzol試劑應加入1ml濃度為75%的酒精，并用已脫酶水進行配制）加入管中洗滌沉淀，進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作。棄去上清液，在真空抽干機中將剩余的酒精除去，加入40-60ml的 DEPC水，在水浴器（55-60℃）中放置 10min，以溶解RNA。用分光光度計檢測RNA的質量及濃度。提取貼壁細胞RNA的方法大致同上。

2.2.2 MiR-150的表達水平檢測 RT:配制逆轉錄工作液，在每個樣品中提取2-3ul的RNA溶液，置于離心管中，依次加入逆轉錄體系中必須的試劑（總體系為25ul）進行震蕩與離心操作，然后置于PCR儀上，設定儀器的運行條件為37℃ 60min-85℃ 5min。qPCR:配制qPCR工作液，在使用cDNA前需用DEPC水將其稀釋20-100倍，按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit (Gene Copoeia)試劑盒的說明書配制qPCR的工作體系，使最終體系達到20ul，用配好的八連管進行震蕩與離心操作，將qPCR工作液置于7500 real-time PCR system上，設定條件為95℃10min-95℃ 10 seconds-60℃ 1min，進行40個循環。從7500 Software v2.0.6 中獲得相關的數據。

2.3 miR-150轉染細胞

2.3.1 細胞的準備 在進行miR-150轉染前一天將HCT-116細胞（0.25×106/孔）和 HT-29細胞（0.4×106/孔）接到6孔板上，當細胞的密度增長到50%時對其進行轉染。

2.3.2 配制轉染工作液 將250ul/孔 的OPTI-MEM和5ul的 miR-150 mimic、250ul/孔 的 OPTI-MEM 和 5ul的Lipofacetime 2000同時進行混合，并進行輕輕吹打，在放置5分鐘后將這兩種預混液混合在一起，在放置20分鐘后再加入到需進行轉染的細胞中。

2.3.3 轉染 去除原來的培養液，把已配好的轉染混合液加入到生長密度達到70%的細胞中，再以1.5ml/孔的1640完全培養基補齊培養混合液，在二氧化碳恒溫箱中培養5個小時后更換新鮮不含抗生素的完全培養基，繼續培養24個小時。

2.4 細胞侵襲試驗

2.4.1 侵襲試驗 在將細胞轉染后進行一天的培養，制作細胞懸液，將細胞的密度調整為5×105/ml，取細胞懸液100μl加入到已解凍的Transwell上室，并在其下室加入600μl含10%PBS的培養基，在對照孔的下室加入不含血清的培養基，在5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養48個小時。

2.4.2 細胞計數 在將細胞培養48個小時后，取出Transwell小室，棄去孔中的培養液，用PBS洗2遍，用4%的多聚甲醛固定15～30分鐘，將小室適當風干，用0.1%的結晶紫染色15～20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細胞，用PBS洗3遍。在200倍或400倍的顯微鏡下隨機選擇5～10個視野觀察細胞并進行計數。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析，用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖分析，本研究中的數據均用均數±標準差（mean±SD）表示，組間差異用獨立樣品T檢驗進行分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 MiR-150在本組7例結直腸癌患者的癌組織與癌旁組織及細胞系中表達的水平

本組7例結直腸癌患者的癌組織與癌旁組織中miR-150的表達水平見圖1A。與在癌組織中表達的水平相比，miR-150在本組患者癌旁組織中表達的水平有不同程度的升高，最高達167倍。將本組患者各結直腸癌細胞系按照MiR-150的表達水平（從高到低）進行排序的情況是：HT-29，HCT-116，SW620，CACO2。詳情見圖1B。

圖1 A：miR-150在7例患者的癌組織與癌旁組織中的表達水平的比較圖1B：miR-150在CACO2、HCT-116、HT-29和SW620的表達水平的曲線

圖2 ：在HCT-116和HT-29中過表達的MiR-150對腫瘤細胞侵襲、遷移能力的影響

4.2 在結直腸癌細胞系中過表達的miR-150對腫瘤細胞侵襲、轉移能力的影響

在結直腸癌細胞系HCT-116和HT29中存在過表達的miR-150，構建過表達miR-150的結直腸腫瘤細胞系進行分析，結果顯示，存在miR-150過表達的HCT-116和HT29腫瘤細胞穿過屏障被染色的5個顯微鏡高倍視野的均數為46與54，其侵襲力分別降低1.9倍和1.5倍，可見過表達的miR-150能夠明顯降低腫瘤細胞的侵襲與轉移能力。詳情見圖2。

5 討論

據報道，miR-150的異常表達與結直腸癌細胞的惡性程度、此病患者的臨床療效及預后密切相關[6]，但其具體調控的分子通路及機制目前仍不明確。我們對7例結直腸癌患者的7對癌組織及癌旁組織進行了miR-150表達水平的定量分析，結果顯示，miR-150在癌旁組織中表達的水平普遍高于其在癌組織中表達的水平。我們在對結直腸癌細胞系中過表達的miR-150進行分析后發現，過表達的miR-150能夠明顯降低結直腸癌細胞的侵襲與轉移能力。這一研究結果與秦教授和馬博士的研究結果相一致[6]。該研究對比分析了大樣本量的正常組織、腺瘤組織與癌組織中miR-150的表達水平，并研究了對腫瘤患者進行隨訪的資料，結果發現，隨著腫瘤組織惡性程度的升高，其中miR-150的表達水平會相應下降。可見，miR-150的表達水平與腫瘤的惡性程度、腫瘤患者對化療的敏感性及其預后有關。miR-150的表達水平越低，腫瘤患者對化療的敏感度越低，其預后越差。我們猜測，miR-150的表達水平在癌旁組織中較高的主要原因可能是，癌旁組織中細胞的自我保護機制可被激活，使miR-150在癌旁組織中的反應性增高，并抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移，進而可抑制腫瘤細胞的生長。有文獻指出，在肺癌[7]及胃癌[8]組織中，miR-150能抑制腫瘤細胞的凋亡及促進其增殖，對腫瘤的發生、進展有促進的作用。在我們的研究中，miR-150在癌旁組織中呈高表達，可作為抑癌因子抑制腫瘤的生長。

MicroRNAs對生命過程的調控主要是通過調控其靶基因的表達來完成的。采用生物信息學的方法進行分析，我們預測miR-150可調控幾百個靶基因，但目前在腫瘤細胞中發現的靶基因較少。MUC4及ZEB1基因分別在胰腺癌及食管癌細胞中得到確認。MUC4是廣泛存在于人體組織中的跨黏膜蛋白。Sanjeev K.Srivastava在其研究中證實，MUC4在胰腺惡性腺瘤及其腫瘤細胞系中的表達量比在正常胰腺組織中的表達量更高。在其他的惡性腫瘤中，MUC4的表達量也可發生異常的改變。MUC4具有促進胰腺癌腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移的作用。MUC4的3‵端非編碼序列中含有miR-150能結合的高度保守序列。研究證實，miR-150能夠直接與MUC4結合，下調MUC4表達的水平，抑制腫瘤細胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲，加強細胞間的粘附作用，抑制腫瘤的進展。我們運用熒光定量PCR法檢測7例結直腸癌患者的癌及癌旁組織中miR-150的表達水平，結果發現其癌旁組織中miR-150的表達水平明顯高于其癌組織中miR-150的表達水平。關于miR-150細胞功能的實驗結果顯示，在結直腸癌細胞系過表達的miR-150能夠抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移?？梢?，miR-150在惡性腫瘤組織中可下調MUC4的表達，抑制腫瘤的生長、集落形成、遷移與侵襲，增強PC細胞間的粘附能力[2]，進而起到抑制腫瘤生長的作用。

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)能 夠 增強腫瘤細胞的遷移及侵襲能力[9]。已有研究成果證實，ZEB1，ZEB2與EMT的發生有直接的關系[10]?；熢雒粢蜃?TNF-α 在對腫瘤進行化療的過程中可起到重要的作用。EMT能夠誘導TNF-α抵抗的產生，在腫瘤的發展中可被異常激活，使腫瘤細胞的侵襲力增強，增加腫瘤的轉移率與治愈后的復發率，并可導致腫瘤細胞耐藥。Takehiko Yokobori在其研究中證實，miR-150能夠下調ZEB1的表達水平，抑制EMT、腫瘤細胞的轉移及耐藥性的發生。ZEB1在結直腸癌侵襲與轉移的過程中扮演著至關重要的角色。在將來的工作中，我們會構建穩定表達miR-150的細胞系，再一次驗證miR-150的功能，驗證MUC4及ZEB1在結直腸癌細胞系中為miR-150直接靶基因的理論。

本研究的結果證實，miR-150在結直腸腫瘤細胞中的高表達能明顯降低其侵襲及轉移的能力，抑制其生長。我們有理由相信，miR-150能夠通過抑制MUC4及ZEB1基因的表達來抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移，進而可控制腫瘤的發展。隨著對MiR-150在結直腸癌中發揮作用的深入了解，我們深信其有可能成為將來治療結直腸癌的潛在靶點，上調其在結直腸癌患者體內表達的水平可抑制腫瘤的生長，增加患者對化療的敏感性，提高患者的臨床療效，改善患者的預后。

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