解凍液I溫度設定對小鼠卵母細胞玻璃化凍融效果的影響

饒金鵬 邱 楓 金 敏

解凍液I溫度設定對小鼠卵母細胞玻璃化凍融效果的影響

饒金鵬 邱 楓 金 敏

目的探討預熱至37℃的解凍液I和預熱至室溫（22℃）的解凍液I對小鼠卵母細胞玻璃化凍融效果的影響。方法對6周齡昆明系雌鼠進行促排卵,脫去顆粒細胞后選取形態良好的MII期卵母細胞，用含不同濃度DMSO+EG的磷酸鹽緩沖液（5%DMSO+5%EG，10%DMSO+10%EG，20% DMSO+20%EG+30%蔗糖）對其進行玻璃化冷凍，儲存2天后對小鼠卵子進行解凍復溫。將卵子隨機分為兩組，一組投入預熱至37℃的解凍液I（含30%蔗糖的磷酸鹽溶液），另一組投入預熱至室溫（22℃）的相同濃度的解凍液I中，再分別移至預熱至室溫（22℃）的解凍液II、III和IV（分別含20%、10%、5%蔗糖的磷酸鹽溶液），隨后對兩組卵母細胞的復蘇率進行統計比較。結果共計對119枚小鼠卵子進行玻璃化凍融，其中61枚置于預熱至37℃的解凍液I，有52枚存活良好，復蘇率為82.25%（52/61），其余58枚置于預熱至室溫（22℃）的解凍液I進行解凍，有23枚存活良好，復蘇率為39.66%（23/58），37℃組的復蘇率顯著高于室溫（22℃）組（P＜0.01）。結論雖然降低平衡時的溫度可以減少高濃度玻璃化冷凍保護劑對卵子的毒性作用，但較快的升溫速度可以幫助卵子快速通過-120℃～-35℃的危險階段，而37℃的解凍液I環境較之室溫（22℃）能更好地加速這一過程，避免重結晶對細胞的致命損傷。

解凍液I；溫度；小鼠；卵母細胞；玻璃化冷凍；復蘇率

人類卵子冷凍作為生育力保存的一種方式，在應對因腫瘤需放療、化療，卵巢早衰等緊急狀況下起著關鍵性作用。但卵母細胞因體積大、膜的滲透性低、紡錘體對溫度敏感，在凍融時極易產生冰晶，而使得凍融復蘇率不高。近期研究表明，玻璃化冷凍技術比傳統的慢速冷凍法更有效[1-3]，但溶液要實現玻璃化狀態，需要更高的冷凍保護劑（CPA）濃度，而濃度的增加意味著對細胞造成更大的毒性及滲透性損傷。降低平衡時的溫度可減少高濃度CPA的毒性作用，降溫也會使得復蘇過程中因升溫速度不夠而導致重結晶的產生[4]。凍融液的溫度選擇生理溫度（37℃）亦或是室溫（22℃）還存在爭議[5-7]。本研究以成熟小鼠卵母細胞（MII期）作為研究對象，將解凍液I的溫度分別設定為37℃和室溫（22℃），通過比較兩組間的復蘇率，評估溫度對重結晶/毒性兩因素的影響，并為今后人類卵母細胞凍融技術的開展積累經驗。

1 實驗材料

1.1 動 物 6周齡雌性昆明系小白鼠（體質量30～35g），購自浙江中醫藥大學實驗動物中心[（動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184）]。

1.2 藥物與試劑 孕馬血清（PMSG）（批號151029）與絨促性素（HCG）（批號150709）均購自寧波第二激素廠，配子處理液G-GAMETE（批號505768）和GIVF（批號505784）購自Vitrolife公司，二甲基亞砜（DMSO）（批號112K2389）購自SIGMA公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號C0221A）購自碧云天生物技術公司，蔗糖（sucrose）（批號78-01-25）購自中國上海試劑一廠，透明質酸酶(hyaluronidas)（批號F078A），人血清白蛋白（HSA）（批號F084A）以及石蠟油（批號E147A）購自SAGE公司。

1.3 耗材與設備 四孔皿購自NUNC公司，60mm培養皿及巴斯德管購自FALCON公司，裝載工具CRYOTOP購自KITAZATO公司。超凈工作臺為丹麥IVFTECH，解剖顯微鏡為日本OLYMPUS，培養箱為美國THEMRO，液氮罐為美國MVE。

2 實驗方法

2.1 玻璃化冷凍解凍液的制備 冷凍液分為濃度由低到高的4個梯度：預平衡液（95%DPBS+5%HSA）；冷凍液Ⅰ（85%DPBS+5%DMSO+5%EG+5%HSA）；冷凍液Ⅱ（75%DPBS+10%DMSO+10%EG+5%HSA）；冷凍液Ⅲ（25%DPBS+20%DMSO+20%EG+30%蔗糖+5%HSA）。解凍液則分為濃度由高到低的4個梯度：解凍液I（65% DPBS+30%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅱ（75%DPBS+20%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅲ（85%DPBS+10%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅳ（90%DPBS+5%蔗糖+5%HSA）。

2.2 凍融前小鼠卵母細胞的準備 雌鼠腹腔注射10IU的PMSG，48h后再注射10IU的HCG，15h后將小鼠頸椎脫臼處死，用注射器于覆油的GGAMETE配子處理液中刺破輸卵管膨大部，擠出成簇卵冠丘復合物（COCs）。置于37℃培養箱4h后，將COCs放入含透明質酸酶（hyaluronidas）的四孔皿內1min，再移入剩余3孔的GAMETE中反復的吹打直至顆粒細胞剝離干凈，此時可選取形態良好的MII期卵母細胞放入培養箱內培養1h待用。

2.3 卵母細胞玻璃化凍融 將預平衡液及冷凍液在室溫下平衡40min,把卵母細胞依次放入預平衡液（2min），冷凍液Ⅰ（2min），冷凍液Ⅱ（3min）以及冷凍液Ⅲ（40s），在1min內將卵母細胞轉移到冷凍載桿上并投入液氮，此即為冷凍過程。2天后，將解凍液分為兩組，1組的解凍液Ⅰ預先放到37℃培養箱預熱1h，另1組則將解凍液Ⅰ置于室溫環境下平衡，而兩組其余解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均置于室溫下平衡40min。解凍時，迅速從液氮中取出載桿，將前端載片浸入解凍液Ⅰ中，輕晃以使得卵子脫落，2min內將卵子轉移到解凍液Ⅱ，再分別將卵母細胞放入解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各3min，最后轉移到G-IVF培養液，放于37℃、6% CO2飽和濕度培養箱后繼續培養。

2.4 卵母細胞存活判斷 經解凍的卵母細胞放于培養箱內培養，次日早間觀察依然可見透明帶與細胞膜完整，卵周間隙清晰，大小正常，折光度好，且沒有明顯的胞漿溢出與皺縮，則判定其存活良好。

2.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件對數據進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.01表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

共計對119枚小鼠卵子進行玻璃化凍融，其中61枚置于預熱至37℃的解凍液Ⅰ，有52枚存活良好，復蘇率82.25%（52/61），其余58枚置于預熱至室溫（22℃）的解凍液I進行解凍，有23枚存活良好，復蘇率39.66%（23/ 58），37℃組的復蘇率顯著高于室溫（22℃）組（P＜0.01）。

4 討 論

本研究比較了不同解凍液Ⅰ溫度環境下，成熟小鼠卵母細胞（MⅡ期）的復蘇率，發現復蘇解凍液Ⅰ設定為生理溫度（37℃）較之室溫（22℃）能獲得更高的復蘇率（P＜0.01）。Larman等[6]發現人MⅡ卵子在37℃解凍液環境下進行復蘇紡錘體完好而在室溫的條件下（21～22℃）解凍則紡錘體發生解聚。這一結果支持了卵母細胞應該在生理溫度（37℃）環境下進行解凍，其不僅能克服重結晶對細胞造成的致命損傷獲得較高的復蘇率，而且紡錘體結構完整性的維持有利于卵母細胞受精及受精后胚胎發育。但龍曉林等[7]通過玻璃化法凍融未成熟人卵母細胞（GV期）的實驗，給出了不同觀點。在其試驗中，37℃環境下GV期人卵母細胞的復蘇率為68.75%（11/16），要低于室溫環境下的復蘇率81.25%（13/16），而后期通過對卵母細胞紡錘體和染色體形態的觀察，也是常溫解凍要優于37℃解凍。考慮到37℃較之22℃確實會增加細胞膜的通透性，而過快的復溫，也可能因體積與溫度的急劇變化而導致透明帶破裂，且過高溫度下接觸EG、DMSO等高濃度滲透性保護劑增加了其化學毒性[4]，所以本研究僅將解凍液I的溫度設計為37℃，以獲得較快的升溫速度幫助卵子加速通過-120℃～-35℃這一重結晶易發階段，而其后的解凍液II、III、IV的溫度均設為室溫則又可以減小殘留的高濃度滲透性保護劑對其產生的滲透毒性。由于選擇的實驗對象為不同的物種的卵母細胞（小鼠/人），或同一物種但處于不同發育階段的卵母細胞（成熟MII期/未成熟GV期），它們的生物特性（例如透明帶通透性）各有差異，加之不同實驗所選擇的玻璃化試劑組成上有所差別，得到不同的實驗結果在所難免。

綜上所述，影響卵母細胞玻璃化凍融的因素很多，結晶的形成、冷凍保護劑的滲透毒性、溫度和滲透壓的改變均會影響其凍融效果。本研究通過將解凍液I設定為37℃與22℃，通過比對MII期小鼠卵母細胞的復蘇率，提示解凍第一步采用生理溫度（37℃）更為合適。

［1］Noyes N，Boldt J，Nagy ZP.Oocyte cryopreservation：is it time to remove its experimental label［J］.J Assist Reprod Genet，2010，27（5）：69-74.

［2］Cao YX，Chian RC.Fertility preservation with immature and in vitro matured oocytes［J］.Semin Reprod Med，2009，27 （6）：456-464.

［3］Forman EJ，Li X，Ferry KM，et al.Oocyte vitrification does not increase the risk of embryonic aneuploidy or diminish the implantation potential of blastocysts created after intracytoplasmicsperm injection：a novel，paired randomized controlled trial using DNA fingerprinting［J］.Fertil Steril，2012，98（3）：644-649.

［4］黃國寧，孫海翔.體外受精-胚胎移植實驗室技術［M］.北京：人民衛生出版社，2012：265-271.

［5］Grifo JA，Noyes N.Delivery rate using cryopreserved oocytes is comparable to conventional in vitro fertilization using fresh oocytes：potential fertility preservation for female cancer patients［J］.Fertil Steril，2010，93（2）：391-396.

［6］Larman M，Minasi M，Rienzi L，et al.Maintenance of the meiotic spindle during vitrification in human and mouse oocytes［J］.Reprod Biomed Online，2007，15（6）：692-700.

［7］龍曉林，黃玉玲，孫筱放，等.凍融液的溫度對人卵玻璃化凍融效果的影響［J］.實用婦產科雜志，2009，25（10）：603-605.

（收稿：2016-06-10 修回：2016-06-17）

Effects of Setting Temperature of Thawing Medium I on Mouse Oocytes Vitrification

RAO Jinpeng,QIU Feng,JIN Min. ReproductiveMedicineCenter,theSecond Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310052),China

ObjectiveTo investigate the effect of thawing medium I preheating to 37℃ and 22℃（room temperature）on mouse oocytes vitrification.MethodsSix-week old Kunming female mice were induced to superovulate.After granulosa cells of cumulus-oocyte-comlexes（COC）were taken off in hyaluronic acid,the mature oocytes were frozen by using phosphate buffer containing different concentrations of DMSO+EG （5%DMSO+5% EG，10%DMSO+10%EG，20%DMSO+20%EG+30%sucrose）.After 2 d,the frozen oocytes were randomly allocated to two thawing groups：thawing medium I（phosphate buffer containing 30%of sucrose）preheating to 37℃group and room temperature（22℃）group,respectively,then both to thawing mediumⅡ,Ⅲ andⅣ（phosphate buffer containing 20%,10%,and 5%of sucrose,respectively）.The survival rates of two groups were calculated.ResultsA total of 119 oocytes were frozen,61 out of which were allocated to thawing medium I preheating to 37℃,and the survival rate was 82.25%（52/61）;the rest 58 oocytes were in thawing medium I preheating to room temperature group,and 23 of 58（39.66%）were survived.A significant difference was found between two groups （P＜0.01）.ConclusionThough balance in lower temperature can reduce the toxic effects of high concentrations of vitrification cryoprotectants on the oocytes,a faster heating rate can help the oocytes quickly pass the dangerous phase of-120℃ ～-35℃.37℃ thawing medium I environment could speed up this process better than the room temperature（22℃）one,and could avoid the recrystallization which cause fatal damage to the cells.

thawing medium I;temperature;mice;oocytes;vitrification;survival rate

浙江大學醫學院附屬第二醫院生殖醫學中心（杭州 310052）

金敏，Tel：13588803459；E-mail：Jinmin76@hotmail.com