多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)建設(shè)及管理

王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

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多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)建設(shè)及管理

王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性最常見(jiàn)的一種生殖內(nèi)分泌疾病，影響世界 5% ~ 10% 的育齡婦女[1]，其臨床表現(xiàn)呈多態(tài)性，包括月經(jīng)紊亂或稀發(fā)、閉經(jīng)，多毛和肥胖，伴卵巢多囊性增大等。PCOS 與不孕和肥胖有關(guān)，可增加患 II 型糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、氧化應(yīng)激、血脂異常和心血管等疾病的終身風(fēng)險(xiǎn)[2]，PCOS 的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是發(fā)病機(jī)制至今不明，目前認(rèn)為是環(huán)境[3]和遺傳因素[4]的共同作用的結(jié)果。PCOS 基因組研究揭示異常基因改變參與多方面生物過(guò)程，主要包括細(xì)胞分化[5]、細(xì)胞增生[6]、細(xì)胞凋亡[7-8]、基因[9]及蛋白表達(dá)[10]等。明確多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展的機(jī)制、個(gè)性化治療方案、療效的隨訪、藥物敏感性研究及新藥研發(fā)等離不開(kāi)大量的生物樣本，因此，江蘇省蘇北人民醫(yī)院建立了高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、信息化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)。

生物樣本庫(kù)又稱生物銀行（biobank），主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲(chǔ)存和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本，包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過(guò)的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用的系統(tǒng)。我院生物樣本庫(kù)規(guī)劃為樣本處理區(qū)和樣本存儲(chǔ)區(qū)，目前存儲(chǔ)設(shè)備可滿足 40 萬(wàn) ~ 50 萬(wàn)份大規(guī)模科研樣本存儲(chǔ)需求，希望能夠?yàn)槎嗄衣殉簿C合征早期干預(yù)、抑制疾病發(fā)展提供強(qiáng)有力的支持。

1 材料與方法

1.1 組織架構(gòu)

我院生物樣本庫(kù)設(shè)有管理委員會(huì)、學(xué)術(shù)委員會(huì)及倫理委員會(huì)，由專職人員負(fù)責(zé)管理。

1.2 環(huán)境設(shè)施

生物樣本庫(kù)占地面積約 400 m2，設(shè)有標(biāo)本取材室、體液處理室、組織處理室、核酸提取室、資料室及低溫存儲(chǔ)室。主要設(shè)備有–196 ℃液氮罐（Taylor-wharton）、–86 ℃超低溫冰箱（Thermo）及室溫石蠟切片柜、24 h 溫控系統(tǒng)（Haier）、4 ℃低溫離心機(jī)（Thermo）、制冰機(jī)（Panasonic）、低溫條碼打印機(jī)（Brady）、石蠟切片機(jī)（Leica）、冰凍切片機(jī)（Thermo）、全自動(dòng)封片染片機(jī)（Sakura）、超微量分光光度計(jì)（Thermo）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）等。

1.3 信息系統(tǒng)

采用無(wú)錫唐頤生物樣本庫(kù)智能信息管理系統(tǒng)，可根據(jù)臨床資料個(gè)性化設(shè)置需求模塊。液氮罐、冰箱、石蠟柜均實(shí)現(xiàn)可視化存儲(chǔ)，能夠與院內(nèi) HIS、LIS、PACS 接口對(duì)接，實(shí)時(shí)獲取臨床資料。貝迪打印機(jī)、掃碼機(jī)、條碼采用低溫二維碼打印并于標(biāo)簽顯示其樣本編碼、采集日期、類型、存儲(chǔ)方式以及存儲(chǔ)位置等。例如，PC-1600720-BS-F-02，代表多囊卵巢綜合征，2016 年第 720 號(hào)入庫(kù)，血清，冰凍存儲(chǔ)，第二復(fù)份。

1.4 流程管理

按照中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)[11]、國(guó)際生物和環(huán)境樣本庫(kù)協(xié)會(huì)（ISBER）樣本庫(kù)管理規(guī)范[12]，結(jié)合我院實(shí)際情況制定生物樣本庫(kù)制度職責(zé)及標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOPs），其中包括人員管理、儀器設(shè)備管理、實(shí)驗(yàn)管理、醫(yī)院感染管理、檔案管理，樣本采集、處理、存儲(chǔ)、質(zhì)量控制、運(yùn)輸流程、銷毀管理等。

多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)的建立已通過(guò)江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，具體采集計(jì)劃由臨床科室、樣本庫(kù)工作人員共同制定并確定一名臨床協(xié)調(diào)人員，每日可采集病例由臨床醫(yī)生確定并簽署知情同意書，一式三份，由臨床科室、生物樣本庫(kù)、患者各執(zhí)一份留存。

1.5 臨床資料收集

我院 PCOS 入庫(kù)樣本臨床資料已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，其中包括：基本信息（姓名、性別、年齡、身份證號(hào)、家庭住址、聯(lián)系方式等），現(xiàn)病史（初診日期、不孕類型、不孕年限、月經(jīng)是否規(guī)律等），既往史（外傷手術(shù)史、預(yù)防接種史、輸血及輸血制品史），必備的檢驗(yàn)/檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、血型、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、TORCH、甲狀腺功能、血胰島素、染色體及陰道 B 超等），診療計(jì)劃（ART 方式、周期類型、治療方式、治療方案、用藥方案、精子來(lái)源方式、卵子來(lái)源、存儲(chǔ)方式以及培養(yǎng)方式等），手術(shù)記錄（取卵日期、取卵時(shí)間、麻醉方式、卵巢大小、卵泡數(shù)量等），胚胎移植記錄（移植日期、移植時(shí)間、子宮位置、導(dǎo)管進(jìn)入宮腔次數(shù)、移植個(gè)數(shù)、胚胎殘留、有無(wú)污染及移植后用藥等），卵子處理記錄（取卵日期、取卵時(shí)間、穿刺卵泡數(shù)、獲卵數(shù)等），胚胎培養(yǎng)情況（培養(yǎng)囊胚數(shù)、形成囊胚數(shù)、高評(píng)分囊胚數(shù)、囊胚胚胎移植數(shù)等）以及隨訪資料等。

1.6 血液標(biāo)本采集流程

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均采集血液標(biāo)本，血液樣本進(jìn)行術(shù)前血采集，其中 8 ml EDTA 抗凝和 5 ml 非抗凝真空采血管采集靜脈血。詳細(xì)填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫離心 10 min，分離血清、血漿，按照每管 300 μl分裝成 5 份，400 ×低溫離心 30 min，于白膜層部提取白細(xì)胞，按照每管 300 μl 分裝成 3 份，所有流程在 2 h 內(nèi)分裝完畢，置于–80 ℃保存。

1.7 卵泡液標(biāo)本采集流程

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均進(jìn)行卵泡液標(biāo)本采集，術(shù)中穿刺卵泡液 50 ml，詳細(xì)填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫 3000 r/min 離心 10 min，分離上清、沉淀，按照每管 15 ml 分裝成 3 份并于–80 ℃保存。

1.8 質(zhì)量控制流程

我院多囊卵巢綜合征樣本庫(kù)定期對(duì)庫(kù)內(nèi)樣本隨機(jī)抽檢進(jìn)行質(zhì)量控制，分別對(duì) DNA 質(zhì)量、定量和純度、RNA 完整性以及樣本的位置信息、臨床信息（基本信息、手術(shù)記錄、臨床診斷、必須檢查、輔助檢查、治療方案、隨訪信息）等規(guī)范性及完整性進(jìn)行檢測(cè)檢查，同時(shí)第一時(shí)間獲取科研使用者結(jié)果反饋。

2 結(jié)果

我院生物樣本庫(kù)已建有三種存儲(chǔ)方式，分別為–196 ℃大型液氮存儲(chǔ)、–86 ℃低溫冰箱存儲(chǔ)以及室溫存儲(chǔ)，多囊卵巢綜合征卵泡液及血液樣本于–86 ℃低溫冰箱存儲(chǔ)，同時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)化操作流程實(shí)施多囊卵巢綜合征采集計(jì)劃。截至 2016 年 10 月 28 日，我院成功收集百余例多囊卵巢綜合征（包括原發(fā)不孕、繼發(fā)不孕、子宮內(nèi)膜異位癥等）卵泡液（上清、沉淀），血液樣本（血清、血漿、白細(xì)胞）。樣本核酸提取及鑒定結(jié)果顯示，DNA 完整性、RNA 純度及總量完全滿足科研需求。

3 討論

近年來(lái)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究與臨床治療連接，快速實(shí)現(xiàn)科學(xué)研究向工程應(yīng)用的重要學(xué)科。生物樣本庫(kù)的構(gòu)建能夠?qū)⒋罅康呐R床獲取的有效樣本統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化采集、處理，將疾病標(biāo)本充分地用于基礎(chǔ)性研究。使得臨床疾病標(biāo)本能夠更加有效利用，基礎(chǔ)研究的取樣來(lái)源更加快捷可靠。樣本庫(kù)對(duì)于樣本的信息直接從臨床管理系統(tǒng)中獲取，來(lái)源更加準(zhǔn)確快捷，避免了中間人工傳抄的誤差，同時(shí)又能夠快速地將實(shí)驗(yàn)研究的信息反饋于臨床的專科醫(yī)生，信息傳達(dá)位點(diǎn)更加精確，打破了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究到應(yīng)用發(fā)展模式中的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間的堅(jiān)冰壁壘，使得基礎(chǔ)信息和臨床思維反復(fù)快速地整合，極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。

隨著自然環(huán)境因素和社會(huì)心理因素的改變，相比過(guò)去，年輕的生育群體中不孕不育以及多囊卵巢綜合征患者數(shù)量呈明顯升高趨勢(shì)。尤其我國(guó)開(kāi)放了二胎政策后，生育能力已經(jīng)明顯下降的大齡婦女要求生二胎的需求在不斷增多。越來(lái)越多的人群開(kāi)始關(guān)注生殖健康問(wèn)題，多囊卵巢綜合征除了會(huì)導(dǎo)致月經(jīng)稀發(fā)和不孕不育等，還與代謝疾病（糖尿病[13]、胰島素抵抗[14-15]、代謝綜合征等[16]），心血管疾病[17]，腫瘤（子宮內(nèi)膜癌[18]）等問(wèn)題有較高的關(guān)聯(lián)性和并發(fā)性。基于全院完整的生物樣本庫(kù)實(shí)時(shí)更新和信息的共享，可以完整地評(píng)價(jià)疾病標(biāo)本對(duì)于開(kāi)展的各項(xiàng)相關(guān)研究的價(jià)值性，有選擇地參與多囊卵巢綜合征不同方向、不同層次、不同組別的實(shí)驗(yàn)隊(duì)列研究。此外，多囊卵巢綜合征的生物標(biāo)本，尤其是卵泡液標(biāo)本，采集技術(shù)要求高，來(lái)源方式單一，基于多囊卵巢的相關(guān)調(diào)查研究，在樣本容量和樣本代表性上有很大的困難需要克服。

我院有發(fā)展規(guī)模成熟的生殖中心，長(zhǎng)期穩(wěn)定地開(kāi)展各項(xiàng)輔助生殖技術(shù)，在院內(nèi)已有的生物樣本庫(kù)的基礎(chǔ)上，增設(shè)多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)，可以實(shí)時(shí)跟蹤利用輔助生殖技術(shù)行卵巢穿刺取卵術(shù)過(guò)程中獲取的卵泡液標(biāo)本，并進(jìn)行信息化管理與應(yīng)用。堅(jiān)持“來(lái)源于臨床，服務(wù)于科研，資源共享、開(kāi)放利用”的原則，極力構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫(kù)，深入開(kāi)展多囊卵巢綜合征及不孕不育等相關(guān)疾病的基礎(chǔ)研究，促進(jìn)多囊卵巢綜合征相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（81601343）；揚(yáng)州市自然科學(xué)基金（YZ2016110）；揚(yáng)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（YZ2015068）；江蘇省蘇北人民醫(yī)院院基金（yzucms201425）

225001 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)（王麗萍、魯軍、潘云龍），生殖醫(yī)學(xué)中心（張曉梅、呂芳、潘宇、李雪麗、何笑）

潘云龍，Email：yzpyl@medmail.com.cn

2016-11-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.013