轉錄組測序技術在中醫藥領域的應用△

張曉萌，李健春，王瓊，羅春

(1.中國人民公安大學醫院，北京 100038；2.四川醫科大學，四川 瀘州 646000；3.成都溫江區人民醫院 內一科，四川 成都 611130)

轉錄組測序技術在中醫藥領域的應用△

張曉萌1，李健春2，王瓊2，羅春3*

(1.中國人民公安大學醫院，北京 100038；2.四川醫科大學，四川 瀘州 646000；3.成都溫江區人民醫院 內一科，四川 成都 611130)

近年來，分子生物學技術已廣泛應用于中醫藥研究，以轉錄組測序技術為基礎的中醫及中藥相關研究受到越來越多研究者的青睞。本文總結了轉錄組學的特點、技術方法，對轉錄組測序技術在中醫證候學、中藥復雜體系、中藥材鑒別及其功能基因研究中的應用現狀進行了綜述。

中醫藥；分子生物學；轉錄組學

中醫是我國的國粹，是中華民族智慧的結晶，其理論在實踐中得到不斷的修正、補充和完善。然而，由于中藥成分復雜、作用機制不明確等因素影響了中醫藥國際化的發展。為了推動中藥國際化和現代化的進程，分子生物學技術被廣泛應用于中醫及中藥研究的各領域，并逐漸扮演著越來越重要的角色。從分子水平研究中醫辨證論治理論，探討中醫藥的作用機制，有望推動中醫藥領域的發展，為中醫藥的發展開辟新的道路。功能基因組學尤其是轉錄組學(Transcriptomics)的研究理論及技術方法應用于中醫藥研究，對中醫藥的發展具有重要推動作用[1]。

1 轉錄組的概念、特點和相關方法

轉錄組是指在某個特定生長周期或生理條件下，某個細胞或組織基因組所轉錄出來的核糖核酸(RNA)總和，包括編碼蛋白質的mRNA和非編碼RNA(ncRNA)，如rRNA、tRNA、microRNA等。與基因組相比，轉錄組的特點表現在：1)具有時間性和空間性特征。與基因組不同，轉錄組受外源和內源因子調控，其基因轉錄情況會隨生長周期、生理條件和外界環境改變而變化[2]，如干細胞和成熟分化的細胞，雖然基因組完全相同，但是基因表達譜卻存在顯著差異；2)信息量相對較小。轉錄組是以基因組DNA為模板，合成RNA為來源，但由于僅有少量的基因組DNA被轉錄，信息量大大縮小，如人類mRNA僅占全基因組總長度的1.5%。

通過分析轉錄組，可以揭示基因表達與一些生命現象之間的內在聯系，對理解機體發育和進化具有重要作用。近年來，人們對轉錄組的研究逐漸深入，已建立了多種轉錄組測序技術，主要有：DNA芯片技術(Gene chip)、大規模平行測序技術(MPSS)、基因表達序列分析(SAGE)以及高通量測序技術等。高通量測序技術近些年發展迅猛，目前主要有以寡核苷酸連接和檢測法(SOLID)、454技術、Solexa等為代表的第二代測序技術和以單分子實時(SMRT)、基于熒光共振能量轉移(FRET)測序、納米孔單分子等為代表的第三代測序技術。轉錄組學的發展為相關研究開辟了新的道路，但其不可否認也存在著一些缺陷，如測序成本過高、如何對獲得的大量數據進行分析等，這些問題亟需研究解決。

2 轉錄組測序技術在中醫藥領域的應用

轉錄組學研究作為一種宏觀的整體論方法，改變了單個基因的研究模式，將基因組學研究帶入了高速發展的時代[3]。以往對中醫學的研究多是單基因研究，忽略了從整體水平闡明中醫藥的各種問題。將轉錄組學應用于中醫藥領域，結合了轉錄組學具有的整體性、時空性等特點，有利于從基因水平解釋中醫辨證論治理論和中醫藥作用機制等問題。

2.1 轉錄組測序技術在中醫證候學研究中的應用

辨證論治作為中醫學臨床診治疾病的主要方法，是中醫學的精髓。由于對證候的判定往往缺乏深層次的客觀標準，所以“證”的確立與臨證醫家的思辨能力和診療水平密切相關，很難做到真正意義上的客觀化和量化[4]。此外，證候的表達是機體反應、整體調控后通過基因功能和相關通路表達出來的，證候是基因組對外界刺激所引起的整體運動的綜合反映[5]，單一的指標并不能作為其判斷標準。鑒于中醫學和轉錄組學皆注重整體性，因而引入轉錄組學的技術方法有望攻克上述兩大難題。

近些年來，已經有很多研究試圖將轉錄組技術引入證候診斷中，作為證候診斷的客觀指標。陸明等[6]用基因芯片研究了虛寒癥肢冷患者基因表達差異，發現與能量代謝相關的有6條，且集中于氧化磷酸化能量通路。嚴石林等[7]通過對慢性腎炎、糖尿病腎病、陽痿3種疾病的腎陽虛證的轉錄組學特征進行分析，發現共同差異表達基因有332條，與腎陽虛證相關的共同信號通路有37個。受此研究啟發，管艷等[8]通過基因芯片技術比較乙肝肝腎陰虛證和肝郁脾虛證患者白細胞基因表達差異，發現兩者基因表達存在明顯差異。這些差異表達的研究為中醫“異病同證”觀點提供了理論依據。若能在不同證候基因差異表達的基礎上建立中醫證型數據庫，則能對病人證候精準、快速地診治，真正意義上實現中醫現代化、國際化。

2.2 轉錄組測序技術在中藥復雜體系研究中的應用

中藥的臨床應用形式多以復方為主，對其研究不僅只需要考慮單味藥作用，更需要考慮各單味藥的相互作用及其整體效應，研究難度很大。因此，中藥復雜體系的研究需要以中醫傳統的理論體系為指導，借助現代生物醫學的研究方法，通過多視角切入、多技術輔助、多學科交叉滲透，才能夠全面、系統、準確地闡明中藥及其復方的作用靶點、作用環節和作用過程[9]。轉錄組學技術為中藥復雜體系的研究提供了新的手段，迄今為止，已有不少研究者在其思路指導下開展對中藥復雜體系的研究，并已取得一定成果。

失神經肌萎縮是指周圍神經損傷后，骨骼肌因失去神經營養作用,出現肌萎縮的癥狀。周嵐等[10]用補陽還五湯治療大鼠腓總神經夾傷模型，用基因芯片技術篩選差異表達基因，發現基因表達差異明顯，上調表達基因14條，下調表達基因10條，并用實時熒光定量PCR(RT-PCR)與免疫印跡驗證了補陽還五湯增強了PI3K基因與蛋白的表達。該研究初步揭示了補陽還五湯延緩失神經肌萎縮的分子機制。金龍膠囊是國內首例抗癌的復方鮮中藥劑，臨床上用于治療肝癌，療效確切，亦對腦腫瘤有一定改善作用。黃卉等[11]用基因芯片聯合RT-PCR方法評估金龍膠囊抗腦腫瘤的藥效及其作用機制。發現表達2倍以上上調表達基因48個，其中上調最明顯基因為VNN1，上調倍數高達48.34倍。說明金龍膠囊可能通過上調VNN1表達發揮抗腦腫瘤的作用機制。段錚等[12]在用基因芯片研究消瘤保肺丸對腫瘤轉移相關基因表達的影響中發現，有30多個基因表達上調大于1.5倍(包括DCC、GPNMB、MCAM、ETV4、FN1等)，提示中藥對肺癌轉移的調控是多層次、多靶點的。謝林等[13]用基因芯片研究補腎益肝活血方對小鼠骨髓基質細胞成軟骨分化相關基因表達的影響，發現了軟骨代謝相關的兩個重要基因Eefmp1、Mmp3存在明顯差異表達，說明補腎益肝活血方治療骨關節炎的作用機制可能與從EFEMP1、MMP3介導的相關通路有關。這些研究從多基因差異表達的角度探索中藥的作用機理，為進一步闡明中藥復雜體系的研究奠定了基礎。

2.3 轉錄組測序技術在中藥材鑒別中的應用

藥材的準確鑒別是確保藥材質量的第一步，但常規的方法對缺乏完整的形態結構或參假復方制劑往往難以鑒定。轉錄組測序技術具有高效、快速、敏感、不受環境改變影響等特點，其有望替代傳統方法成為藥用動植物分類鑒定、識別假冒偽劣藥材的新方法。

蔣超等[14]用忍冬及其變種紅白忍冬經轉錄組測序技術(RNA-Seq)測序獲得的表達序列標簽(EST)序列，經生物信息學手段篩選出87對重復次數具有差異的表達序列標簽-簡單重復序列(EST-SSR)，進一步篩選獲得3對可準確鑒別忍冬及其變種、山銀花原植物的引物：jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65。亦有研究者根據SSR多態性信息初步鑒定淫羊藿[15]、人參[16]等品種。Carles等[17]用基因芯片技術鑒定了幾種有毒中藥。Zhang YB等[18]用基因芯片技術鑒別了復方藥材中石斛的不同種屬，并制作了16個鑒定不同種屬石斛的基因芯片。

2.4 轉錄組測序技術在中藥材活性成分生物合成及調控研究中的應用

研究轉錄組信息可發現，許多中藥材可能參與次生代謝產物生物合成，調節植物生長發育及環境響應的基因，為鑒定中藥材參與有效成分生物合成的功能基因提供極為豐富的參考資料。

張爭等[19]用454技術對機械損傷后的白木香木質部轉錄組進行測序和功能分析，發現了新Unigene 13 611條。通過同源性搜索，獲得參與沉香倍半萜合成相關Unigene 26條，獲得200余條可能編碼轉錄因子的Unigene。Wenping H等[20]用Solexa技術獲得鼠尾草Unigene 56 774 條，其中有1539條可能參與5個主要次級代謝合成通路。Li Y等[21]通過對甘草的轉錄組數據分析發現，分別可能與甘草酸骨架合成相關的酶的基因16個、甘草酸合成的基因9個。Xu Z等[22]用SMRT技術結合新一代測序技術(NGS)對丹參根不同組織轉錄組進行研究，通過對轉錄組水平分析，發現丹參酮主要在根周皮組織產生并累積。

3 結語

中醫藥是我國古老的文化瑰寶，中醫藥現代化是將中國傳統醫藥的優勢與現代科學技術緊密地結合起來，繼承傳統，走出傳統，走向現代。應用轉錄組測序技術對中醫藥領域進行系統性研究，從現代分子生物學角度為中醫藥理論提供強有力的支撐，將會對中藥現代化起到重要的作用，加強西方社會對中醫藥的認識。但是中醫藥轉錄組研究也存在許多亟需解決的問題，如建立中醫證候疾病模型動物難度大、轉錄組學分析的局限性(蛋白質作為生命活動的執行者，往往須經過翻譯后修飾才能成為功能蛋白，但RNA轉錄量不變)等。因此，須結合眾多新興組學，例如蛋白質組學和代謝組學的研究[22-25]，多視角切入，多技術輔助，幫助人們更深層次地認識中醫藥學。

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ApplicationofTranscriptomeSequencingTechnologyinTraditionalChineseMedicine

ZHANGXiaomeng1，LIJianchun2，WANGQiong2，LUOChun3*

(1.TheChinesePeople’spublicsecurityhospital，Beijing100038，China；2.SichuanMedicalUniversity，Luzhou646000，China；3.ThePeople’sHospitalofWenjiangDistrictinChengdu，Chengdu611130，China)

In recent years，molecular biology technology has been widely applied in traditional Chinese medicine (TCM).Based on the transcriptome sequencing technology，many TCM researchers focus their study on it.This paper summarized the characteristics of the transcriptomics，the methods and the applications in the TCM syndrome，the complex system in Chinese herbal medicine，the identification of Chinese herbal medicine and its functional gene research.

Traditional Chinese medicine；molecular biology；transcriptomics

2015-06-21)

人因工程重點實驗室開放基金資助項目(HF2012-K-06)；四川省科技廳-瀘州市人民政府-瀘州醫學院聯合科研資金項目(14JC01323-LH50)

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羅春，主治醫師，研究方向：中藥藥理學；E-mail：328322357@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.033