珍稀藥用植物三葉青種質資源研究現狀△

彭昕，吉慶勇，梁雅清，張煜炯，樓天靈

(1.浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100；2.麗水市農業科學研究院，浙江 麗水 323000)

珍稀藥用植物三葉青種質資源研究現狀△

彭昕1*，吉慶勇2，梁雅清1，張煜炯1，樓天靈1

(1.浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100；2.麗水市農業科學研究院，浙江 麗水 323000)

三葉青是珍稀中藥材，臨床應用廣泛，其野生資源瀕危，人工栽培難度大，品種選育落后，導致生產中種質退化，品系混雜，嚴重影響了臨床用藥的安全穩定。本文綜述了近年來三葉青種質資源分類、繁育、保存、鑒定及評價等方面取得的研究進展，分析了目前其種質資源研究與利用中存在的問題，以期為三葉青產業的可持續發展提供參考。

三葉青；人工繁育；種質鑒定；資源評價

三葉青Tetrastigmahemsleyanum是我國浙江、江西等南方部分地區的珍稀藥用植物品種。中文學名為三葉崖爬藤，又名金線吊葫蘆，為葡萄科崖爬藤屬植物，以地下塊根或全草入藥。是抗腫瘤常用藥物，也具有抗炎、解熱、護肝等作用[1-3]，是多種中成藥(如華佗風痛寶膠囊、排石利膽膠囊、結石康膠囊、金絲地甲膠囊、金芪片等)的主要藥味，也被開發成保健品。藥理研究顯示總黃酮、總氨基酸和多糖為其主要活性物質[3-5]。目前三葉青野生資源瀕臨滅絕，人工栽培難度大，其藥用部位地下塊根生長慢，需要3～5年才能達到商品藥材的要求。2011年三葉青被列入“浙江省首批農作物種質資源保護名錄”。不同產區、不同種質三葉青的外觀性狀(大葉/小葉，紫藤/青藤)、地下塊根產量以及有效成份含量存在明顯差異。由于資源稀缺而需求量大，偽混品眾多，近年來杭州等地先后出現多起患者服用混入烏頭子根的含三葉青飲片中藥中毒事件。另一方面，三葉青種子產量少或無，且是多年生植物，有性繁殖慢，農家生產歷來采用扦插等無性繁殖，只種不選，自繁自用的狀況加重了性狀退化，嚴重影響了臨床療效，因此資源保護開發與評價、品種選育是三葉青生產及應用上亟待解決的重要課題。筆者結合本課題組近年來的相關研究成果就三葉青種質資源分類、繁育、保存、鑒定及評價等方面取得的研究進展進行了總結和分析，以期為三葉青資源的進一步研究及開發利用提供參考。

1 種質資源研究現狀

1.1 種質類型和產地分布

三葉青種質類型主要從葉片大小和形狀、表面革質程度，葉邊鋸齒、藤顏色和形狀上區分，一般大致分為紫藤和青藤兩種[6]：青藤三葉青老藤的表面青白色，藤本較粗壯，葉片較大，塊根個體較大，主要分布于我國湖南、福建、廣西、云南的部分地區。紫藤三葉青新藤為綠色，一般2～3年后植株下部老藤逐漸變成紫色或褐色。藤本較細小，有棱角，葉片較小，塊根多呈葫蘆狀，主要分布于浙江、江西等地。相比之下，青藤三葉青分布地域較廣，生長旺盛，產量較高，數量較多。但一般認為青藤三葉青塊根性寒，藥用功效不及紫藤三葉青。

1.2 人工繁育技術

1.2.1 組培快繁 鐘毓倩等[14]以三葉青莖尖、葉片及帶腋芽的莖段為外植體，認為其誘導愈傷最佳的外植體為莖尖，并篩選出適合不定芽繼代增殖的培養基及生根培養基類型。錢麗華[15]通過篩選比較愈傷誘導、增殖以及不定根誘導的主要影響因子，初步摸索了三葉青不定根擴繁的激素條件，為今后通過三葉青不定根培養工業化生產其藥用活性成分奠定了技術基礎。史清英[16]對三葉青莖段外植體組織培養體系進行了優化，并發現在其組培苗根部定殖印度梨形孢，可明顯促進組培苗的生長發育，其株高和干鮮重都顯著高于未接種的三葉青幼苗。杜蘇瑞[17]利用發根農桿菌K599侵染三葉青實生苗或組培苗的葉片，成功誘導出轉基因毛狀根，為利用三葉青毛狀根作為生物反應器大規模生產三葉青次生代謝物提供了理論依據和技術支撐。

本課題組在三葉青組培快繁[7-8]、懸浮細胞培養[9-10]及次級代謝調控[11-12]方面研究確定了促進愈傷組織生長、最利于黃酮積累的最佳培養基配方和培養條件，確定了通過腋芽增殖的三葉青快繁育苗技術[7-8]；比較了兩種三葉青細胞懸浮體系中細胞增殖和總黃酮積累的動態，構建了增殖系數大，繼代后性能穩定，總黃酮含量高于原植株的三葉青懸浮細胞系[9，12]。研究了稀土元素對三葉青懸浮細胞代謝相關酶活性及同工酶表達的影響，結果顯示100 μM Ce3+和 Nd3+最有利于其生物量及黃酮的積累，50～200 μM稀土離子對CAT，POD，PAL，EST等酶表達情況有顯著影響；稀土離子誘導生物量及黃酮積累的機理與其激發初生及次生代謝途徑中關鍵酶的合成，誘發脅迫防御反應，提高細胞代謝水平有關[10]。通過對稀土離子的誘導效應和Ca2+信號通路的關系進行研究顯示，在培養基中加入金屬誘導子與降低鈣離子濃度或增加鈣離子阻斷劑相結合的方式，能促進三葉青懸浮細胞增殖及提高其黃酮產量[11]。通過對繼代多次的三葉青愈傷組織的遺傳穩定性進行了考察，研究表明繼代4次以內的愈傷組織遺傳穩定，但繼代次數增加，增加了DNA點突變和種性退化的機率，提出為避免保存的原始種質基因丟失，盡可能采用試管苗方式繼代保存[13]的建議。

1.2.2 人工栽培 浦錦寶等[20]利用500 mg·L-1的生根粉溶液浸泡插穗的下切口，實現了人工繁育三葉青的目的。程良綏[21]從選地與整地、幼苗繁育、林下種植、林地管理、病蟲害防治、塊根采收等方面總結三葉青林下栽培技術。Dai[22]對在自然光照和不同程度遮蔭處理條件下栽培30天的三葉青光合能力，葉綠素熒光性和葉綠素含量進行了比較研究，實驗結果顯示 67%的遮陰處理時三葉青苗葉子最大，且光合作用最強，為栽培三葉青提供了最佳光照條件的參考依據。

本課題組研究了生根劑、插穗年齡和基質對三葉青插穗生根的影響，顯示2～3 年生老枝于1000 mg·L-1IBA 浸漬 10s 后扦插于黃土中生根效果最佳[18]。并收集11 個浙江、江西、湖南等產地三葉青種質資源，進行扦插試驗，比較其農藝性狀與生長特點，結果表明，不同種源三葉青插穗生長速度、新梢長、莖粗及葉長、葉寬均存在極顯著差異 (P<0.01)[19]。本課題組負責的“珍稀藥用植物三葉青資源收集及人工種植技術研究”、“三葉青經濟林下套種關鍵栽培技術”分別于2013、2014年通過了浙江省科技成果鑒定。

1.3 種質鑒定

1.3.1 外部形態、顯微結構或理化鑒別方法 由于三葉青野生資源瀕臨滅絕，藥材市場上偽混品盛行，嚴重影響了其臨床用藥的安全性和有效性。李水福[23]從原植物形態、藥材性狀和顯微鑒別三方面總結了三葉青與其常見偽品土圞兒的區別特征。殷紅妹[24]通過性狀觀察、理化鑒別和高效液相色譜法成功鑒別了三葉青及其偽混品烏頭。黃真[25]從藥材外部性狀、顯微特征及一般理化鑒別等方面對浙江及廣西產地的三葉青進行生藥學鑒別，為三葉青藥材品種鑒別提供了實驗依據。

然而傳統中藥材外部形態、顯微結構或理化鑒別方法由于產地粗加工和飲片炮制導致外部性狀、顯微特征破壞，且同一藥材的化學成分含量受生長周期、貯存條件、炮制方法和生長環境等多方面的影響會有明顯變化，因此傳統鑒別方法均存在一定局限性。

1.3.2 分子生物學鑒別方法 近年出現的分子生物學鑒定技術不受供試部位、生長發育階段以及環境條件的影響，直接利用DNA序列進行物種的鑒定，具有獨一無二的準確性和可重復性，實驗過程標準化，操作簡單快速。王一涵[26]通過選擇具有多態性的 ISSR 通用引物擴增三葉青及其近緣種和市場上常見偽品土圞兒后產生的三葉青特異性條帶，設計了特異性擴增該片段的特異性三葉青 SCAR 分子探針引物，在12個不同種源的三葉青中均能產生陽性擴增，而與三葉青偽品土圞兒和16個近緣物種的 DNA 均不反應。符淵淼[27]對多段DNA條形碼在三葉青及其它崖爬藤屬植物鑒別中的應用基礎進行了研究，發現rbcL+matK+ITS是鑒定三葉青和其它崖爬藤屬植物的最佳條形碼，通過對待測樣品該DNA條形碼區測序后，計算遺傳距離聚類鑒別。

本課題組在前期以ITS2序列為基因標記探討三葉青與其近緣物種親緣關系及其多種偽混品ITS2區測序的研究基礎上，建立了一種快速、可靠鑒別三葉青的PCR-RFLP方法[28]，可直觀判斷藥材三葉青的真偽及是否摻入了偽混品。與前述方法相比能有效縮短三葉青的鑒定時間；結果為共顯性，可以區別出正品三葉青、非三葉青以及摻入了偽品的三葉青；且該方法擴增的ITS2片斷僅為400～500 bp，因此受模板質量及PCR擴增條件的影響較小，不易出現假陰性的結果，大大提高了鑒定的準確性。

以上三葉青種質鑒別的分子生物學方法克服了感官或理化分析等方法難以鑒別三葉青真偽的技術問題，保障了三葉青藥材用藥安全，具有重要的實用價值。

1.4 種質資源類型的評價

1.4.1 不同種質資源類型的農藝性狀及經濟性狀評價 對三葉青藥用原植物種質資源的遺傳多樣性進行評價和群體遺傳學的研究，對制定其種質資源保護利用的策略以及指導其遺傳育種工作顯得尤為重要。蹇京蓉[6]通過標本查閱、野外考察和其它相關數據分析，確定了野生三葉青產地主要包括了13個省區，選取了生長速度、栽培難度、繁殖難度、抗病蟲害、抗逆性、多糖含量、總黃酮含量等指標構建評價體系，對不同產區三葉青藥用原植物種質資源現狀進行了全面評價。結果表明：來自浙江地區的種質資源具有顯著的優越性，其次是來自江蘇和江西的，而湖北的種質資源綜合評價得分最低。然而，一些綜合評估中等甚至較低的種質，如：西藏、重慶的種質資源在某些指標，如抗寒性、耐高溫性、抗旱性等方面具有極高的優勢。該種質資源評價分析結果對于今后的遺傳育種工作將具有重要的指導意義。金月山[29]調研了野生三葉青資源的自然分布現狀，收集了福建、湖南、廣西3地三葉青種質，通過性狀特征對比和塊根成分檢測，認為廣西三葉青藥用效果相對較低，呼吁規范三葉青藥材市場，合理利用三葉青資源。本課題組測定了人工種植和野生三葉青中總黃酮含量，結果顯示浙江麗水人工種植三葉青品質優良適于推廣種植[30]。鄭軍獻等[31]測定了浙江和廣西產地10份三葉青樣品中總黃酮的含量，結果顯示不同產地藥材黃酮含量差異最大可達7倍。許文等[32]采用UPLC-MS/MS 定量分析測定30 批不同產地三葉青中 10 種黃酮類成分結果表明，各類成分含量差異懸殊，甚至有些批次中未檢測出。因此，不同產區、不同品種的三葉青有效成分含量及藥理活性均差異懸殊，多項研究表明浙江產區三葉青提取物在解熱[2]、抑制肝癌細胞增殖[33]的活性等方面都占有明顯的優勢。

1.4.2 種質資源的遺傳多樣性評價 袁帶秀[34-35]研究發現不同種源地的三葉青酯酶、POD同工酶存在表達差異。本課題組分別對三葉青ISSR[36]、SRAP[37]反應體系和擴增程序進行優化，建立了穩定可靠、多態性好、可用于三葉青遺傳多樣性分析的遺傳分子標記體系，并將其應用于三葉青野生及人工栽培居群27份種質資源的遺傳變異水平和結構分析的研究[38]，結果表明三葉青種質遺傳變異主要存在于地理居群間，群體間基因流低，野生居群遺傳多樣性顯著高于人工栽培群體，遺傳相似性與地理距離有一定的相關性，在此基礎上初步分析了三葉青野生資源瀕危的原因主要是低水平基因流、地理屏障、無性繁殖及資源過度開發，提出了保護其種質資源的策略。

王一涵[39]采用petL-psbE和trnK-matK基因間隔區對 21 個三葉青群體共 223個個體進行了群體遺傳學研究，結果顯示三葉青野生群體可劃分為西部、中部和東部三個地理居群，其遺傳變異主要存在于群體間，基因流極低。Wang[40]采用雙抑制PCR法從來自于重慶和福建產區的少量三葉青樣品中探索性地發掘了14個SSR位點，為開發三葉青特異性狀的遺傳標記，實現分子輔助遺傳育種奠定了基礎。

1.5 種質資源保存

現有的常規植物離體快繁及保存技術需要頻繁繼代、工作量大、成本高，易導致材料的污染、混淆，且隨著繼代次數的增加，遺傳變異率提高，從而使保存的原始種質基因丟失，出現代謝物含量變化、植株再生能力下降等現象，嚴重影響試管苗的質量和利用價值。

本課題組建立了一種穩定高效的三葉青種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法[41-42]。通過適宜的培養條件和合理的抑制劑、破眠劑使用，建立三葉青試管苗的限制生長保存以及保存后復蘇培養技術體系，使其試管苗保存10個月期間不需繼代，植株生長正常，存活率為100%，大大延長繼代培養時間，且保存材料的后代經DNA和蛋白質分子標記技術檢測均未發生遺傳變異。因此該方法可防止常規的傳代保存法由于多次傳代后造成的種性退化及病毒感染，保證種質的優良性和純潔性。

2 三葉青種質資源與利用研究展望

三葉青種質資源作為維持其產業可持續發展的源頭，深入地開展種質收集、鑒定和評價研究是提升三葉青良種化水平、種質創新與利用的關鍵，但目前多數研究尚停留在形態學觀察、粗成份測定和簡單的分子標記聚類上，為充分開發利用和合理保護三葉青種質資源，今后的研究工作可在以下方面深入開展：

2.1 建立完善、系統的三葉青種質鑒定、質量評價體系

三葉青種質資源遺傳多樣性研究目前已有形態學、細胞學和分子水平，盡管各種研究方法均在一定程度上體現出其遺傳資源的豐富程度，然而這些研究的聚類結果之間缺乏有機的統一，甚至個別研究結果間差異較大，這可能是因為各地引種的種質類型本身的差異，或是由于不同生境引起的遺傳突變。目前，三葉青種質的品質評價一般根據農藝性狀(如：塊根產量)和部分成分(如總黃酮)的含量來確定，缺乏對其功能性指標成分或分子指紋等方面的準確鑒定。不同產地不同種質三葉青藥材的模式識別及系統評價尚未見報道。因此，構建一個完善、系統的從遺傳基礎到藥效基礎，從基因型到表現型，從定性到定量的三葉青基原種質的科學評價體系的工作亟待開展。

2.2 開展特異遺傳性狀的分子水平深度評價，運用現代分子生物學技術實現分子輔助遺傳育種

本課題組目前雖然已有較成熟的三葉青栽培示范苗圃，但在近年來的栽培繁育過程中，也出現了抗病抗寒性差、黃酮含量不穩定、遺傳特征逐年退化等現象。因此建立三葉青抗寒性、抗病性評價體系，并對其抗性機制進行分析，篩選抗性種質和抗性基因，開展三葉青功能性成分的評價，篩選優異種質資源，將有利于三葉青種質資源的高效利用。采用常規普通育種技術需觀察后代性狀分離現象，而其每一代的生長周期即長達數年，因此亟需開展與目標性狀關聯的分子遺傳標記的開發，運用現代分子生物學技術實現分子輔助遺傳育種。

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ResearchProgressinUtilizationofTetrastigmahemsleyanumGermplasms

PENGXin1*，JIQingyong2，LIANGYaqing1，ZHANGYujiong1，LOUTianling1

(1.ZhejiangPharmaceuticalCollege，Ningbo315100，China；2.LishuiAcademyofAgriculturalScience，Lishui323000，China)

Tetrastigmahemsleyanumis a precious and rare medicinal herb，which is widely used in clinic.The wild resources ofT.hemsleyanumare on the verge of extinction.The artificial cultivation ofT.hemsleyanumencountered great difficulties，such as a long growth period，andthe poor speciesbreeding.Allof the above lead to thatT.hemsleyanumnow has suffered from mix of variety and degeneration of genetic characterization，which would severely influence the safety and effectiveness for its clinical use.This paper reviewed the research progresses in classifications，breeding，identification，and conservation ofT.hemsleyanumgermplasms.the problems and future research fields of the development ofT.hemsleyanumgermplasms was also put forward.

Tetrastigmahemsleyanum；artificial breeding；germplasm identification；resource assessment

2015-09-20)

浙江省公益技術項目(2013C32103)；浙江省高校訪問工程師校企合作項目(FG2014008)；寧波市農業攻關項目(2014C10031)；寧波市科技創新團隊(2015C110027);浙江省中醫藥科技計劃項目(2013ZA119)；浙江省新苗人才計劃(2013R433007)

*

彭昕，副教授，研究方向：中藥生物技術；E-mail：px4142@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.034