大鼠急性心肌梗死模型的建立

楊文慧　郭　濤　楊　莉　華寶桐　劉　娟

(昆明醫科大學附屬延安醫院老年病科，云南　昆明　650051)

?

大鼠急性心肌梗死模型的建立

楊文慧郭濤1楊莉華寶桐1劉娟2

(昆明醫科大學附屬延安醫院老年病科，云南昆明650051)

摘要〔〕目的探討建立一種能模擬臨床心肌梗死事件及其病理生理變化的動物模型。方法SD大鼠麻醉后，經口插管連接小動物呼吸機，開胸高位結扎冠狀動脈左前降支。術后1 w超聲檢測大鼠心功能，TTC染色測量心肌梗死面積，評價模型制作效果。結果手術成功率為100%，術后1 w動物存活率為90.9%。術后1 w超聲檢查見大鼠LVEDS、LVEDD較術前擴大，LVFS較術前降低(P<0.05)。大體見缺血區心室壁變薄塌陷。TTC染色測算梗死面積占左室面積的百分比為 35.80%±4.32%。結論本文成功建立大鼠心肌梗死模型。該模型成功率高、心肌梗死面積穩定，可運用于心肌缺血、心力衰竭、心肌重構的發病機制和治療方法研究。

關鍵詞〔〕動物模型；心肌梗死

1昆明醫科大學第一附屬醫院心內科

2昆明醫科大學第二附屬醫院心內科

第一作者：楊文慧(1982-)，女，在讀博士，主治醫師，主要從事冠心病、心律失常的基礎及臨床研究。

心肌梗死是冠心病最嚴重的類型〔1～3〕，深入認識其發病機制并預防它的發生、改善心肌梗死患者的預后一直是研究的重點。為此，需要建立穩定的動物模型來模擬人體發生心肌梗死的病理生理過程，并在此基礎上開展研究。因模型制作過程中進行麻醉、呼吸機使用、手術操作以及心肌梗死病變本身的病理特點，導致造模的成功率低、動物術后存活時間較短、模型平行性差等問題，不利于后續的研究。本研究采用開胸高位結扎大鼠左冠前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，旨在為進一步的研究提供穩定可信的動物模型。

1材料與方法

1.1動物7周齡雄性SD大鼠55只，體重230～290 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供〔SCXK(湘)2013-0004〕。

1.2主要試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國Sigma公司(批號：101060270)；異氟烷：上海雅培制藥有限公司(批號：685632U)；烏拉坦注射液；4%甲醛溶液。

1.3主要儀器小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司制造，ALC-V9型)，心臟超聲儀(GE Vivid E9)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司)；手術器械若干。

1.4模型制作

1.4.1麻醉及氣管插管術前禁食、水12 h。9%烏拉坦按照1 ml/100 g劑量進行腹腔注射麻醉〔4〕。注射前回抽針管，以確定沒有刺入血管中。大鼠麻醉后，用皮筋掛住大鼠的門齒及四肢，將大鼠仰臥位固定于180 mm×250 mm自制木板上。手術燈探照大鼠頸部，用紗布包裹大鼠舌并向外向上牽拉，可清晰觀察到聲門，用18 G 38 mm筆筒型靜脈留置針經口插入大鼠氣管插管，連接小動物呼吸機。觀察大鼠的呼吸頻率與呼吸機一致，確認氣管插管成功后用膠布固定。呼吸機參數設定為：呼吸頻率75次/min，吸呼比1∶1，潮氣量13 cc。

1.4.2冠脈結扎大鼠胸部去毛，消毒手術區域，沿胸骨左緣剪開皮膚，鈍性分離肌肉，剪斷第3、4肋骨，暴露胸腔。用小動物開胸器撐開胸廓，拉出胸腺并固定。小心剪開心包膜暴露心臟，以肺動脈圓錐與左心耳交界處找到左前降支，在左心耳下方1～2 mm處與肺動脈圓錐間用5-0號線縫合〔5〕。進針深度1～1.5 mm，約縫合5 mm寬心肌，以保證結扎住動脈〔6〕。以心尖處變蒼白為結扎成功標志。清除胸腔內殘存積血。

1.4.3關閉胸腔及圍術期護理檢查無出血后，用0號線連續縫合肋骨。關閉胸腔之前用5 ml針筒連接套管針負壓吸引胸腔內空氣及殘留滲血，同時擠壓胸壁。然后逐層縫合肌肉、皮膚。約5 min后先松開呼吸機接口，觀察到大鼠自主呼吸恢復再拔出氣管插管。觀察大鼠呼吸情況，若呼吸道分泌物過多或者有舌后墜應及時處理。術中及術后麻醉未蘇醒前可用烤燈照射，保持動物體溫，利于術后恢復。

1.5模型鑒定

1.5.1心臟功能評價造模后1 w行心臟超聲檢查。異氟烷吸入麻醉大鼠，心前區備皮，仰臥位固定。心前區涂抹耦合劑，使用GE Vivid E9彩色超聲儀、9L-D高頻探頭(頻率10.0 MHz)，在二維超聲引導下運用M型超聲經胸骨旁左室長軸切面，觀察室壁運動情況，測量左室收縮末內徑(LVEDS)、左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室短軸縮短率(LVFS)，取3個心動周期的平均值。

1.5.2大體病理造模后1 w處死大鼠，迅速取出心臟，置于預冷生理鹽水中洗去血液，剔除心房、右心室及筋膜組織。余左心室組織置-20℃冰箱中2 min，取出后沿橫切面將左室心肌均勻切成1 mm薄片。將切片放入37℃預熱過的1%TTC溶液中，置于水浴恒溫振蕩器中，37℃振蕩染色10～15 min，用4%甲醛液固定24 h，觀察染色結果。非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色〔7〕。將染色的心肌切片置于生理鹽水中，用直尺設定好標尺后照相，用Imagepro-Plus圖像處理軟件分析測量缺血面積，計算缺血面積占左心室面積百分比。

1.6統計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1手術存活率55只大鼠均完成急性心肌梗死模型制作，手術成功率為100%。其中，1只因麻醉時掙扎，導致趾甲斷裂、甲床出血；1只因咬傷舌頭至舌出血，給予包扎止血后仍于術后當天死亡。另有3只大鼠在手術第2天死亡，考慮可能與心力衰竭有關。術后1 w有50只心肌梗死模型大鼠存活，存活率為90.9%。

2.2超聲心動圖檢查術后1 w超聲檢查可見左心室前間隔運動減弱，左心室擴大，左室短軸縮短率降低。見表1。

表1　冠脈結扎前后超聲檢查大鼠心功能改變±s)

與術前比較：1)P<0.01

2.3大鼠心肌組織TTC染色造模后1 w處死大鼠取出心臟觀察，大鼠心臟出現左室壁變薄，局部塌陷，表面顏色灰暗。TTC染色后觀察到，非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色。測量計算梗死面積占左室面積的百分比為 35.80%±4.32%。

3討論

目前，廣泛采用結扎大鼠冠脈左前降支的方法制作心肌梗死模型。有學者采用導絲逆行牽拉氣管插管的方法制作20只大鼠心梗模型，手術成功率95%，1 w存活率為90%〔8〕。另有研究進行了10只大鼠心梗模型制作，4 w存活率僅60%〔9〕。本研究術后1 w存活率均高于上述報道。與以往大鼠心肌梗死模型相比，本文采用靜脈留置針管經口插管進行機械通氣，保障手術安全同時最大限度減小大鼠損傷；采用剪開肋骨方法暴露手術視野，避免過度擠壓牽拉心臟及大血管，同時使手術視野清晰易于操作；高位結扎大鼠冠脈左前降支，使心肌梗死部位及面積相對固定，模型平行性好。

3.1模型動物的選擇當通過結扎等方法使冠狀動脈急性閉塞制造急性心肌梗死的動物模型時，犬類等自身側支循環豐富的動物一般不宜選用。這些動物由于自身原有的側支血管豐富，冠狀動脈急性閉塞后側支循環迅速開放，很少形成大面積的心肌梗死，難以達到研究的要求。豬等大型動物的經濟投入較大，手術操作的難度大，對實驗設備要求高。而小鼠體型較小，需要在顯微鏡下進行操作，對術者的要求較高。相比之下，采用大鼠制備心臟疾病的模型具有較多優勢〔10〕。大鼠容易飼養，術后管理較容易。單人就能模型制作，對實驗儀器要求不高，便于實驗的開展。大鼠的品系比較純正，動物組內差異較少，在基因組學和蛋白質組學研究中具有更多的優勢。同時，大鼠的冠脈系統側支循環比較少，結扎后容易出現較固定的缺血區，使心肌梗死的模型制作更加穩定。

3.2麻醉方式大鼠麻醉的給藥方式腹腔注射麻醉和吸入麻醉。熟練的術者完成一例大鼠急性心肌梗死模型的制作約需20 min，期間需保證大鼠絕對安靜。吸入麻醉可控制麻醉深度及復蘇時間，但需配備有吸入式小動物麻醉機，實驗成本較高。腹腔注射麻醉維持時間較長，能滿足模型制作的要求。烏拉坦、戊巴比妥鈉、水合氯醛等都是常用的大鼠腹腔麻醉藥物，本實驗采用烏拉坦腹腔注射麻醉取得較好效果。

3.3氣道建立大鼠氣管插管比較常見的是氣管切開插管和經口插管。氣管切開插管對大鼠損傷較大，手術操作時間延長，縫合不當可能導致氣管狹窄，也可能出現氣道分泌物和血液堵塞氣道。由于大鼠的聲門較小，術者不易看清楚聲門的位置，因此本實驗中用紗布包裹后將大鼠舌頭提起，手術燈照射大鼠頸部，此時可清晰觀察到大鼠聲門。術者用柔軟的靜脈留置針管進行經口插管，不易損傷大鼠口咽及氣道黏膜，同時一次成功率高，避免反復插管引起黏膜水腫導致手術失敗。

3.4手術開胸手術開胸有沿肋間隙進胸和切開肋骨進胸等方式。文獻報道在第2肋間隙進胸獲得滿意的效果〔11〕。但是大鼠心臟體積較小，且心率較快，充分暴露手術視野方可保證冠脈結扎的成功率。因此，在本實驗中我們切開第3、4肋骨進胸，小動物開胸器擴開胸廓，固定胸腺，能充分保證手術視野清晰，易于術者操作。術后仔細止血，逐層關胸，并用套管針連接針筒抽吸胸腔內殘余氣體，術后大鼠的恢復較好。

3.5冠脈結扎定位大鼠冠脈左前降支由左冠狀動脈主干分出，行于動脈圓錐和左心耳之間，然后向右下行于前室間溝內。左冠狀動脈主干和前降支起始端與伴行靜脈的關系極為密切，高位結扎很易成功，低位結扎因動靜脈關系不恒定，較不易成功〔12〕。本研究在左心耳下方1～2 mm處結扎左前降支，結扎后即可觀察到心尖部心肌變為蒼白色，術后超聲及病理檢查確認模型制作成功，心肌梗死面積穩定。大鼠冠狀動脈主干及其主要分支均位于淺層心肌內，活體不易辨認，而其伴行靜脈為肉眼可見的白色細小線條，因此，復制心肌梗死模型結扎動脈時，以伴行的靜脈為標志。

綜上所述，結扎大鼠左冠狀動脈前降支復制的心肌梗死模型與心肌梗死實際發病過程比較符合，其梗死分布范圍相對一致，病理生理改變與臨床心肌梗死相似，是目前被廣泛采用的造模方法。按照本實驗操作方法可順利完成多只大鼠急性心肌梗死模型的制備，術后經超聲大體觀察和TTC染色病理觀察確認模型制作成功。該方法成功率高、模型穩定，可為心臟疾病相關研究提供可靠的大鼠模型。

參考文獻4

1Fihn SD，Blankenship JC，Alexander KP，etal.2014 ACC/AHA/AATS/PCNA/SCAI/STS focused update of the guideline for the diagnosis and management of patients with stable ischemic heart disease：a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines，and the American Association for Thoracic Surgery，Preventive Cardiovascular Nurses Association，Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，and Society of Thoracic Surgeons〔J〕.J Am Coll Cardiol，2014；64(18)：1929-49.

2Moran AE，Forouzanfar MH，Roth GA，etal.Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions，1980 to 2010：the Global Burden of Disease 2010 study〔J〕.Circulation，2014；129(14)：1483-92.

3Wang W，Hu SS，Kong LZ，etal.Summary of report on cardiovascular diseases in China，2012〔J〕.BES，2014;27(7)：552-8.

4Jonckers E，Delgado Y, Palacios R，etal.Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice〔J〕.Magn Resonan Med，2014;72(4)：1103-12.

5Wu Y，Yin X，Wijaya C，etal.Acute myocardial infarction in rats〔J〕.J Vis Exp，2011;(48):pii:2464.

6Gao E，Koch WJ.A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse〔J〕.Meth Mol Biol，2013;1037(3)：299-311.

7Redfors B,Shao Y，Omerovic E.Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice〔J〕.Exp Clin Cardiol，2012;17(4)：4.

8張治國，葉亮，曹浩.大鼠急性心肌梗死模型的建立〔J〕.同濟大學學報(醫學版)，2011;32(2)：44-6.

9王燕，陳光輝，尹作民，等.大鼠心肌梗死動物模型的制備〔J〕.中國比較醫學雜志，2010;20(6)：5.

10Flister MJ，Prokop JW，Lazar J，etal.2015 Guidelines for establishing genetically modified rat models for cardiovascular research〔J〕.J Cardiovasc Trans Res，2015;8(4):269-77.

11Fu YH，Lin QX，Li XH，etal.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction〔J〕.Method Find Exp Clin Pharmacol，2009;31(6)：367-73.

12Xu Z，Alloush J，Beck E，etal.A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery〔J〕.J Vis Exp，2014;23(86):1131-5.

〔2015-05-11修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：郭濤(1957-)，男，教授，博士生導師，主要從事冠心病、心律失常的基礎及臨床研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260027)；云南省應用基礎研究項目(2014FZ051)

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6019-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.007