人牙髓干細胞增殖及血管內皮生長因子表達與低氧預處理的關系

田曉蓓　黎　婷　宋文婷　孫晉虎

(徐州醫學院口腔醫學院,江蘇　徐州　221004)

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人牙髓干細胞增殖及血管內皮生長因子表達與低氧預處理的關系

田曉蓓黎婷宋文婷孫晉虎

(徐州醫學院口腔醫學院,江蘇徐州221004)

〔摘要〕目的探討人牙髓干細胞(hDPSCs)增殖及血管內皮生長因子(VEGF)表達與低氧預處理的關系。方法收集健康完整恒牙，采用組織塊酶消化法培養hDPSCs，取3～5代生長良好的hDPSCs分為低氧組(30 ml/O2)和常氧組(210 ml/O2)培養，采用MMT、qRT-PCR和ELISA等技術檢測細胞增殖、VEGF表達量。結果低氧組培養第2、3天hDPSCs的增殖活性OD值分別為(0.69±0.13)和(0.90±0.22)，明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組和常氧組培養第1、4天hDPSCs增殖活性OD值差異無統計學意義(P>0.05)；hDPSCs分別培養24、48、72 h后，低氧組細胞形態仍呈長梭形，同常氧組的細胞形態相似，兩組細胞活性良好，均未發現有細胞壞死的現象發生；低氧組培養24、48和72 h VEGF mRNA相對表達量分別為(2.47±0.08)、(15.07±2.10)和(4.10±0.12)，明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組培養24、48和72 h VEGF表達量分別為(598.10±43.18)、(674.84±23.32)和(802.31±23.07)pg/ml，明顯高于常氧組(P<0.05)。結論低氧預處理能顯著促進hDPSCs增殖及VEGF表達，提示低氧預處理可能對hDPSCs體內移植有利。

〔關鍵詞〕人牙髓干細胞；低氧預處理；血管內皮生長因子；細胞增殖

第一作者：田曉蓓(1979-)，女，碩士，講師，主要從事牙體牙髓病學研究。

低氧環境普遍參與機體生理病理的發生發展過程，參與胚胎及多種疾病的發生中，相關基礎領域研究特別是腫瘤微環境理論認為，間充質干細胞在體內適宜生長環境為輕度缺氧環境，牙髓干細胞作為間充質干細胞，在人體內的生長同樣需求低氧環境〔1，2〕。近年來相關牙髓干細胞體外分析研究多數采用常氧環境，而部分學者認為，體外低氧環境下培養牙髓干細胞能顯著促進細胞增殖，增加移植成功率，并認為血管內皮生長因子(VEGF)通過自身水平的顯著變化，進而促進低氧環境下牙髓干細胞的增殖〔3，4〕。本研究重在探討人牙髓干細胞(hDPSCs)增殖及VEGF表達與低氧預處理的關系。

1材料與方法

1.1hDPSCs分離培養收集患者因阻生或正畸需要拔除的健康完整恒牙，采用組織塊酶消化法培養hDPSCs，當原代細胞長滿瓶底超過80%時，行常規傳代并擴大培養。

1.2hDPSCs分組培養取3～5代生長良好的hDPSCs接種于60 mm細胞培養皿中，隨機分入低氧組(30 ml/O2)和常氧組(210 ml/O2)中培養，其中低氧組氧體積分數從210 ml/O2降至30 ml/O2時間約為2 min，當氧體積分數穩定至30 ml/O2后分別培養24、48、72 h。

1.3MTT法檢測hDPSCs增殖取第3～5代牙髓干細胞接種于96孔細胞培養板(3×103)，分為常氧組和低氧組進行培養，每孔設置5個復孔，分為培養1、2、3、4 d，每孔加入20 μl MTT(南京凱基生物科技有限公司，濃度：5 mg/ml)，37℃繼續孵育4 h，去除上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，使用酶標儀(上海華科儀器有限公司 型號：BS-1101)測定波長為490 nm OD值。

1.4細胞活性檢測細胞經過相關培養后加入PI/Calcein-AM混合熒光染色液，37℃孵育15～30 min，去除染色液，PBS漂洗一次，顯微鏡下觀察(死細胞染色為紅色，活細胞為黃綠色)。

1.5hDPSCs表達VEGF檢測VEGF轉錄水平及蛋白水平的表達差異采用Q-PCR和ELISA檢測，所有試劑均購自南京凱基生物科技有限公司，相關檢測方法嚴格按照說明書。

1.6統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1hDPSCs的生長及形態采用組織塊酶消化法培養分離得到hDPSCs，約在第6～8天從牙髓組織塊邊緣游出，倒置顯微鏡可見細胞呈長梭形、成纖維樣細胞形態，胞質豐滿，胞核清晰，細胞核橢圓居中，平均3～5 d傳代一次，隨著生長密度增加，細胞呈放射狀或渦旋狀排列。見圖1。

圖1　hDPSCs鏡下觀察

2.2hDPSCs增殖情況低氧組培養第2、3天hDPSCs增殖活性OD值明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組和常氧組培養第1和4天hDPSCs增殖活性無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.3細胞活性檢測hDPSCs分別培養24、48、72 h后，低氧組細胞形態仍呈長梭形，同常氧組的細胞形態相似，兩組細胞活性良好，均未發現有細胞壞死。

2.4hDPSCs VEGF蛋白及mRNA表達情況低氧組培養24 h、48 h和72 h VEGF蛋白和mRNA相對表達量明顯高于常氧組(P<0.05)，見表2和3。

表1　兩組hDPSCs增殖活性OD值情況

表2　兩組VEGF mRNA相對表達量比較

表3　兩組VEGF表達比較

3討論

hDPSCs為存在于人牙髓組織中的間充質干細胞，相關組織微環境理論認為，間充質干細胞具有自我增殖和多向分化潛能，臨床上普遍采用從拔出的第三磨牙等牙組織中獲取hDPSCs，由于其來源于自身組織，相關移植免疫反應較輕，是較為理想的牙髓再生研究的細胞株〔5〕。目前多數研究仍采用體外常氧環境對于hDPSCs進行培養研究，劉偉等〔4〕發現，常氧培養的間充質干細胞經過移植后，組織缺血缺氧的發生率較高，約65%細胞發生凋亡。而聶姍姍等〔6〕發現，在采用濃度為30 ml/O2的低氧預先處理hDPSCs后，細胞存活率顯著增加，同時組織發生缺血壞死的比例呈現降低趨勢。文軍等〔7〕認為，低氧環境預先處理hDPSCs后，可能通過刺激VEGF生成，進而促進細胞存活，提高移植成功率。低氧是牙髓干細胞較為適宜的生長環境〔8，9〕。Kuo等〔10〕發現，采用濃度為40 ml/O2預先處理牙髓間充質干細胞后發現，細胞增殖活力及活性均較為理想，同時細胞形態較為典型，無明顯細胞凋亡及細胞碎片。 Gu等〔11〕通過MTT測定hDPSCs細胞在40 ml/O2低氧環境中增殖效應后發現，在培養中段時間內，OD值所測得的hDPSCs增殖活力較為顯著，明顯高于常氧環境中的細胞。Kuo等〔10〕通過低氧處理hDPSCs后發現，在低氧處理的3 d內，細胞在450 nm波長處吸光度值明顯高于常氧對照組，而 Pisciotta等〔12〕認為，在細胞增殖、再生中具有重要前驅性作用的VEGF可能顯著參與低氧促細胞增殖、生長的機制中。Gao等〔13〕發現，低氧處理的hDPSCs其VEGF轉錄水平表達顯著上調，但蛋白水平未予研究。本研究提示VEGF可能顯著參與低氧的促增殖效應中。血管再生是牙髓移植的重要組成部分，而VEGF在血管的發生和形成中發揮了中樞性的作用。張男等〔14〕認為，血管再生及血供的及時建立能有效提高細胞移植的成功率，并認為VEGF所介導的內皮細胞增殖、分化和遷移是血管內皮再生的最重要調節因素。史欣〔15〕也認為，VEGF所介導的血管再生作用在低氧促牙髓移植成功的機制中發揮了重要作用。

綜上，體外低氧環境可以促進hDPSCs增殖，通過低氧環境預先處理需要移植的細胞能顯著增加移植成功率，VEGF基因轉錄水平及蛋白水平的上調可能顯著參與血管再生調節過程中，進而提高移植成功率，但相關具體機制仍需進一步探討。

4參考文獻

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4劉偉，凌均棨.牙髓干細胞誘導分化為血管內皮細胞的研究進展〔J〕.國際口腔醫學雜志，2014;34(6)：707-11.

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10Kuo TF，Lee SY，Wu HD，etal.An in vivo swine study for xeno-grafts of calcium sulfate-based bone grafts with human dental pulp stem cells (hDPSCs)〔J〕.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2015;50(2)：119-23.

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12Pisciotta A，Carnevale G，Meloni S，etal.Human dental pulp stem cells (hDPSCs)：isolation，enrichment and comparative differentiation of two sub-populations〔J〕.BMC Developmental Biol，2015;15(1)：14-5.

13高麗，王玉霞，江文欣，等.轉導hTERT基因致人牙髓干細胞永生化的研究〔J〕.上海口腔醫學，2015;24(2)：135-40.

14張男，王偉，陳保興，等.人體牙髓干細胞的分離與鑒定〔J〕.中華細胞與干細胞雜志(電子版)，2014;4(3)：32-5.

15史欣.骨橋蛋白對人牙髓干細胞成骨分化的旁分泌作用的研究〔D〕.哈爾濱：哈爾濱醫科大學，2014.

〔2014-09-25修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：孫晉虎(1969-)，男，博士，教授，主要從事口腔頜面疾病研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(No.31060167);徐州市科技項目(No.kc14sh114);江蘇青藍工程學術帶頭人資助項目(2014)

〔中圖分類號〕R31

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6328-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.004