REP、RAPD和PFGE方法在志賀菌分子分型中的應用評價

李 琦 姜大棟

（遼寧省大連市中山區疾病預防控制中心，遼寧 大連 116013）

REP、RAPD和PFGE方法在志賀菌分子分型中的應用評價

李 琦 姜大棟

（遼寧省大連市中山區疾病預防控制中心，遼寧 大連 116013）

目的探討REP、RAPD和PFGE方法在志賀菌分子分型中的應用效果。方法 以細菌基因組重復序列（REP）、隨機擴增多態性分析（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（PFGE），分別對60株志賀菌分子進行分型，并對3種方法加以評估。結果 REP、RAPD和PFGE的分子分型結果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個亞型，其中，51株可分為A、B、C、D、E五型，其余6株宋內志賀菌為1單獨型。結論 在3種分子分型方法中，REP對高菌株分辨率差，在區域內菌株分型方面，不具優勢；RAPD分辨率高、分型精準，但需花費較長時間；PFGE明顯優于前二者，分型效果更為細致，三者之間的差異性顯著，但PFGE操作更簡便，用時更少，價格更低，而且對于細菌性痢疾暴發事件，有較好的病學調查效果。

REP；RAPD；PFGE；志賀菌分子；分型

伴隨分子生物學的發展，出現了便于操作、分辨率高、易于推廣的分型技術；在病原菌分子分型方面，有許多方法，但目前還未形成集諸多優點于一體的綜合性方法。當前的PFGE分型技術屬于該領域的“金標準”，與REP、RAPD相比，優勢更為明顯[1]。本組研究中，以細菌基因組重復序列（REP）、隨機擴增多態性分析（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（PFGE），分別對60株志賀菌分子進行分型，并對3種方法加以評估。現將具體情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：以REP、RAPD、PFGE，分別對60株志賀菌分子進行分型。首先，準備好儀器與試劑；本組實驗中，選擇GeneLight 2004型PCR擴增儀、JY300C型電泳儀、JY02S型紫外分析儀、脈沖場凝膠電泳儀，選擇PFGE圖像分析軟件；系統有凝膠成像系統；本組實驗中，選擇的試劑有瓊脂糖、TAE緩沖液、溴化乙錠、蛋白酶K、TaKaRa Tap kit、Marker DL2000、XbaI、Not Ⅰ限制性內切酶、Seakem Gold低熔點瓊脂糖；選擇中國疾病預防控制中心傳染病的標準Marker H9812。

1.2 方法：首先，對DNA提取；對志賀菌單個菌進行分離，并將其落傳種于M-H平板；其次，孵箱培養，溫度控制在35 ℃，以16 h為培養期；第三，對三環四環菌株進行雙蒸水混合（100 μL），需將溫度控制在95 ℃，一般煮5 min即可，室溫離心以每分鐘12000轉為宜，30 s時間即可；DAN的提取，選擇上清即可；第四，運用REP、RAPD、PFGE 3種方法進行具體檢測。

1.3 統計學方法：應用SPSS19.0軟件操作系統進行數據統計，計量資料用（）表示，計數資料用χ2檢驗，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結 果

REP、RAPD和PFGE的分子分型結果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個亞型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋內志賀菌為1單獨型。

3 討 論

本組研究中，采用REP、RAPD、PFGE，分別對60株志賀菌分子進行分型；在REP檢測方面，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’為單引物序列設計；在PCR體系中，選擇TapDNA聚合酶（5 U/μL）和緩沖液（Mg2+plus，選擇5 μL為宜），還有Dntp（4 μL）、25 mmol/L MgCl2（2 μL）、10 μmol引物（5 μL）、模板DNA（5 μL）、無菌雙蒸水（需補足，總反應體積為50 μL）、液體石蠟（30 μL）；PCR擴增條件選擇94 ℃（3 min）、94 ℃（1 min）、40 ℃（1 min）、65 ℃（2 min，30個循環）、65 ℃（10 min）；瓊脂糖凝膠電泳方面，對上面步驟所產生的物質與loading bufer進行混合，先取15 μL，再與10 ×loading bufer物進行均勻混合，再加入含有1%的EB，置于瓊脂糖凝膠孔中，此時，需將DNA marker DL 2000同時加入；電壓100 V，電泳時間以3 h為宜，注意必須在紫外燈下進行細致觀察，并對結果加以記錄；此檢測中，以肉眼觀察，并進行Tenover標準判讀，作為判定標準[2]。

在RAPD檢測中，以5’-GCGCCGLCATGCGGCATT-3’為單引物序列設計；在PCR體系中，選擇TapDNA聚合酶（0.5 μL）、10*緩沖液（Mg2+plus，選擇5 μL為宜），還有10 mmol/L Dntp（4 μL）、25 mmol/L MgCl2（5 μL）、10 μmol引物（5 μL）、模板DNA（5 μL）、無菌雙蒸水（需補足，總反應體積為50 μL）、液體石蠟（30 μL）；PCR擴增條件選擇94 ℃（3 min）、94 ℃（30 s）、30 ℃（30 s）、72 ℃（60 s，30個循環）、65 ℃（5 min）；瓊脂糖凝膠電泳方面，對上面步驟所產生的物質與loading buffer進行混合，先取15 μL，再與10×loading buffer物進行均勻混合，再加入含有1%的EB，置于瓊脂糖凝膠孔中。此時，需將DNA marker（100 bp Ladder）同時加入；電壓100 V，電泳時間以3 h為宜，注意必須在紫外燈下進行細致觀察，并對結果加以記錄；此檢測中，可忽略條帶密度，若條帶數、位置相同，則歸于同一類型；通常的判定標準以條帶數目差≥2時，歸于異型[3]。

在PFGE檢測中，以“金標準”分析法為主，需使用限制性內切酶Not Ⅰ（對福氏志賀菌）；對于宋內志賀菌、標準株H9812，則需選擇限制性內切酶Xba Ⅰ，按照指紋圖譜分析軟件進行分析（BioNumerics software）。結果顯示，REP、RAPD和PFGE的分子分型結果顯示，采用REP方法，有A、B兩型；采用RAPD方法，有A、B、C、D、E、F六型；采用PFGE方法，共有3個亞型，其中，51株可分A、B、C、D、E五型，其余6株宋內志賀菌為1單獨型。

綜上所述，REP對高菌株分辨率差，在區域內菌株分型方面，不具優勢；RAPD分辨率高、分型精準，但需花費較長時間；PFGE明顯優于前二者，分型效果更為細致，三者之間的差異性顯著，但PFGE操作更簡便，用時更少，價格更低，而且，對于細菌性痢疾暴發件，有較好的病學調查效果。

[1] 丁水軍.脈沖場凝膠電泳技術及其在病原菌分子分型中的應用[J].中國衛生檢驗雜志,2012,12(53):110-111.

[2] 李雪,金莉莉,王秋雨.病原微生物分子分型技術研究進展[J].中國公共衛生,2015,11(8):147-148.

[3] 孫永艷,申泉,李艷琴.腸桿菌基因間重復共有序列及應用[J].生命的化學,2014,13(6):10-11.

R378.2+5

B

1671-8194（2016）36-0021-02