巨自噬及分子伴侶介導自噬在類風濕關節炎中的相互作用及其聯系①

孫英煥　吳　茜　李春蒔　李林靜　李光迪

(蘭州大學第二醫院檢驗中心，蘭州730000)

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巨自噬及分子伴侶介導自噬在類風濕關節炎中的相互作用及其聯系①

孫英煥吳茜李春蒔李林靜李光迪

(蘭州大學第二醫院檢驗中心，蘭州730000)

1　自噬的概述

自噬又稱為“自我吞噬”(Self-eating)，是進化保守的細胞內溶酶體分解代謝過程，在細胞的生存、變異、發育及維持內環境穩態中發揮著必不可少的作用。細胞降解細胞質成分并回收利用營養素，同時自噬也參與固有免疫，與淋巴細胞的發育、形成和增殖有關[1]。研究發現自噬與自身免疫性疾病、腫瘤、代謝異常、氧化應激等病理過程密切相關。根據細胞內物質轉運到溶酶體的方式不同，在哺乳動物細胞中分為三類：巨自噬(Macro-autophagy)、微自噬(Microautophgy)、分子伴侶介導自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)。細胞可通過不同的自噬途徑清除錯誤折疊、受損的蛋白質，為細胞的再循環提供必需原料。盡管不同的自噬途徑有其獨特的性狀并可在特定狀況下被激活，但近期研究表明，不同的自噬途徑之間相互聯系、互為補充[2]。

2　巨自噬在類風濕關節炎發病機制中的作用

2.1巨自噬及其過程巨自噬由內質網來源的雙層膜結構包裹細胞質中的可溶性蛋白和細胞器形成自噬泡，并攜帶進入溶酶體內形成自噬溶酶體后被水解酶降解，為細胞的再生修復提供原料[3]。它存在于從酵母到哺乳動物的所有真核生物中，是目前研究最為深入的一種自噬途徑。其過程如下：首先在生存壓力下(缺血缺氧、氧化應激、腫瘤、感染)等作用條件下，胞漿內形成內質網來源的獨特雙層膜結構，膜結構不斷向周邊延伸成扁平狀，稱之為自噬前體(Phagophore)，自噬前體的形成是發生自噬的標志性改變之一；隨后，自噬前體不斷延伸，逐漸包繞胞漿內某些正常或異常的營養物質及細胞器，形成封閉的球體結構，即自噬體(Autophagosome)；最后，自噬體通過細胞骨架被運送至溶酶體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(Autolysosome)后被水解酶降解，此途徑最終通過通透酶的作用將氨基酸、糖類和脂質轉運到胞液中二次利用[4]。

2.2巨自噬的調控

2.2.1PI3K/Akt/mTOR信號通路機體內存在多種巨自噬信號調控通路，目前研究最為深入的是PI3K/Akt/mTOR信號通路。該信號通路可參與體內不同生理病理過程，被激活后可對細胞自噬產生抑制作用。磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Phosphatidylin-ositol 3-kinase ，PI3K)活化后可催化磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)在D3位的磷酸化，形成三磷酸磷脂酰肌醇[Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3]。該物質可進一步與細胞內含有PH結構域的信號蛋白AKT(蛋白酶)和磷脂酰肌醇依賴(Phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)結合,促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，導致AKT活化，將信號下傳至雷帕霉素靶蛋白(mamma-lian target of rapamycin，mTOR)[5,6]，進一步磷酸化Atg13，抑制Atg1與Atg13、Atg17的結合，導致自噬體的形成受阻。mTOR作為自噬誘導劑可通過抑制上述途徑促進自噬發生[7]。

研究表明Ⅲ型PI3K(Vesicular proteinsorting 34，Vps34)是調控PI3K通路上的關鍵物質，可與PI3K以PI為底物獲得PI3P[8]。但此過程需要Beclin1蛋白的參與，形成Vps34-Vps15-Beclin1復合體。自噬發生時Vps34-Vps15-Beclin1和多種自噬相關蛋白結合，促進自噬發生[9]。

2.2.2Beclin1信號通路Beclin1蛋白是巨自噬的特異性蛋白，為抑癌基因，屬于Bcl-2家族。為酵母ATG6 的同源物,大部分位于內質網中，定位于人類染色體 17q21[10]。其結構中有一個在進化中高度保守的結構域被命名為Beclin1ECD，是自噬誘導過程中的必需結構域[11]。與ClassⅢPI3K形成復合物(Vps34-Vps15-Beclin1)而參與自噬體膜的形成，并有引導其他自噬相關蛋白在自噬體膜上定位、促進自噬溶酶體形成的作用[12]。應用RNA干擾Beclin-1表達可以明顯降低LC3Ⅱ的生成，抑制自噬體形成[13]。LC3蛋白又稱微管相關蛋白輕鏈3(microtu-bule-associated protein 1 light chain 3,LC3)，為酵母ATG8 基因的同源物。在哺乳動物中分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型經泛素樣修飾后與磷脂酰乙醇胺結合,形成LC3Ⅱ在溶酶體中降解。LC3Ⅱ定位于自噬體膜,其形成依賴于Atg12-Atg5復合物[14]。

2.3巨自噬在類風濕關節炎中的作用RA是一種自身免疫性疾病，病理特點為關節滑膜病變導致慢性滑膜損傷和血管翳形成，血管翳又稱絨毛，是造成關節破壞的基礎。在顯微鏡下觀察大部分由巨噬細胞樣滑膜細胞(Macrophage-like synoviocytes)和成纖維樣滑膜細胞 (Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASF)組成。Wu等[15]研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路對RA滑膜細胞增殖有重要作用。Xu等[16]研究表明，用轉染Beclin siRNA 抑制自噬途徑，RASF較骨關節炎滑膜成纖維細胞(Osteoarthritis synovialfibroblasts，OASF)中Beclin1和LC3的表達水平明顯升高，而國內在外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的研究結果與其相反，其機制尚不明確[17]。抗環瓜氨酸抗體(Anticyclic citrullinated peptide antibody，Anti-CCP)具有較高的敏感性而作為RA的血清標志物之一廣泛應用于臨床，Ireland等[18]研究發現自噬抑制劑3-甲級腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)或Atg5表達水平與抗CCP抗體水平呈正相關。

3　CMA在類風濕關節炎發病機制中的作用

3.1概述及過程 CMA僅存在于哺乳動物的不同細胞類型中，如纖維母細胞、肝細胞、星型膠質細胞、巨細胞以及一系列的癌癥細胞等[4]。與其他兩種自噬過程的本質區別在于其不形成自噬囊泡，而是通過獨有的溶質蛋白轉運至溶酶體然后進行降解[19]。Rajawat等[20]研究發現，隨著年齡的不斷增加，衰老可能會影響溶酶體相關膜蛋白(Lysosomeassociated membrane protein type 2a，LAMP-2a)與底物蛋白的的結合，說明CMA可以維持內環境穩態。CMA被認為是一種具有高度選擇性的降解過程，熱休克蛋白70(Heat shock cognate chaperone of 70，Hsc70)在CMA途徑中發揮重要作用。Hsc70聯合其他的分子伴侶(Hsp40、Hsp90、hip、bag-1等)識別特定的目標降解蛋白攜帶的五肽相關序列KFERQ與底物蛋白結合形成分子伴侶-底物復合物到達溶酶體膜，與溶酶體膜受體LAMP-2a結合。這些底物蛋白可以轉運至溶酶體腔被迅速降解并在細胞內重新循環利用，主要是依賴溶酶體Hsc70(Ly-Hsc70)，并不涉及溶酶體膜的變形。此過程主要包括兩個蛋白復合體即底物所識別的分子伴侶復合體和LAMP-2a跨膜復合體[4，21]。

3.1.1底物所識別的分子伴侶復合體Hsc70位于hspa8編碼的11號染色體上。可促進蛋白折疊或裝配，還可以通過囊泡參與網格蛋白的分離和蛋白的重組，除此以外，也可通過內質網和線粒體的轉位合成新的蛋白質。KFERQ與細胞質內的Hsc70及其分子伴侶復合物結合并幫助其穿過溶酶體膜進入溶酶體腔，Hsc70與底物的結合受ATP酶和水解酶的調控，其中前者占主導地位。Hsc70既存在于細胞質中，同時Ly-Hsc70也是CMA所必需的轉運底物并起決定性作用。Ly-Hsc70相當于細胞質中Hsc70的酸性同種型，具有相同的等電點。用中和抗體通過內吞作用首先阻斷成纖維細胞中的Ly-Hsc70，CMA將會受阻，而阻斷Hsc70對CMA無影響。Hsc70既是底物，也與CMA受體具有交互作用，但目前我們尚不清楚在轉運到溶酶體腔前有多少Hsc70發揮作用[22-26]。同時，不同的研究者研究的對象不同。有些研究者側重于細胞內Hsc70，而有些則著重于溶酶體腔中的Hsc70。

3.1.2LAMP-2a跨膜復合體LAMP2是一跨膜溶酶體糖蛋白，可維持溶酶體的完整性。經過可變剪接后分三個亞型，LAMP-2a、LAMP-2b和LAMP-2c。它們具有相同的高氮端糖基化。用RNAi抑制小鼠成纖維細胞中的LAMP2同源多聚體證實只有LAMP-2a參與CMA，而LAMP-2b可能在巨自噬中發揮作用。LAMP-2c的作用尚不明確[27]。溶酶體膜上的受體LAMP-2a與Ly-Hsc70結合是CMA的關鍵步驟，而LAMP-2a是此過程的關鍵蛋白[28]。Kiffin等[29]研究表明輕微的氧化刺激可以通過CMA途徑使氧化蛋白降解，LAMP-2a高表達。

3.2分子伴侶介導自噬在類風濕關節炎中的作用Schick等[22]在正常人和RA患者的滑膜組織中研究發現Hsc70高表達，其上調機制可能與抗原加工提呈有關。同時有研究發現CMA在主要組織相容性復合體Ⅱ類復合物(Major histocompatibility complex class Ⅱ-mediated，MHC Ⅱ)抗原加工提呈過程中發揮關鍵作用，而免疫紊亂是RA發病的主要機制[30]。LAMP-2a與RA的關系迄今為止國內外未見報道。Cacciottolo等[21]研究表明在包涵體肌炎患者中LAMP-2a和Hsc70高表達。另有研究表明[31]，氧化應激狀態下體內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，伴隨自由基清除劑超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)低表達。ROS 不僅參與細胞的增殖、分化及凋亡等生理過程，還可以激活自噬。氧化應激是RA發生的一個重要因素，RA患者在過氧化能力增強的同時，抗氧化能力會減弱。RA患者的外周血和滑膜液中高表達ROS和活性氧產生的分子[32]。CMA也被稱為是一種應激途徑，曹麗麗等[33]研究發現氧化應激時，LAMP-2a、ROS高表達，SOD低表達，這都提示氧化應激可能可通過調節CMA參與RA的發病，但機制尚不明確。

4　巨自噬與CMA的聯系

在生理學和病理學條件下，巨自噬與CMA作為兩種重要的自噬途徑在細胞內蛋白質的轉換和再利用過程中發揮著決定性作用[4]。盡管兩者在細胞內的發生機制不同，但研究顯示兩者存在一定的聯系。可能是因為在巨自噬和CMA交互過程中，持續的巨自噬活性增強導致溶酶體腔內pH值暫時增高，從而降低Ly-Hsc70的穩定性并使之失活，最終導致一過性的CMA的活性降低[34]。在營養匱乏早期，巨自噬途徑被激活產生必需氨基酸，隨著時間的延長，CMA將會取代巨自噬途徑，降解非必需蛋白從而獲得氨基酸，維持細胞的生存。說明CMA與巨自噬存在代償關系[35]。巨自噬的這種分子補償機制可能是因為CMA的損傷，而具體機制不明確，但已被證明CMA阻斷的早期通過RNA干擾LAMP-2a，巨自噬活性降低是由于增加了mTOR活性，而長時間阻斷CMA將導致細胞內Beclin 1高表達,減少mTOR的磷酸化[4]。唐莎[36]研究發現ANAC相關性血管炎中LAMP-2a抗體可以使Beclin1和LC3高表達。Wu等[4]對53名帕金森綜合征患者的PBMCs研究中發現當阻斷CMA時巨自噬途徑將會上調。在那么在RA中上述聯系是否存在又是如何發揮作用的，目前尚見文獻報道。

5　展望

綜上所述，隨著人們對巨自噬和CMA研究機制不斷深入，我們發現兩者在RA的發病機制與疾病的發展存在一定的關系。但通過何種途徑造成RA發病以及如何加劇病程進展的機制目前我們尚不清楚，這需要更深入的研究，尋找早期診斷RA的分子標志物以及有效的藥物治療靶點，減少RA患者致殘率，提高患者的生活質量。

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[收稿2015-12-30修回2016-03-16]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.035

孫英煥(1990年-), 女，在讀碩士，主要從事自身免疫性疾病研究，E-mail:494062307@qq.com。

及指導教師：李光迪(1960年-)，男，碩士生導師，主要從事自身免疫性疾病的研究工作，E-mail: guangdi843133@163.com。

R593.22

A

1000-484X(2016)10-1566-04

①本文為蘭州市科技計劃項目(2014-1-35)。