血流感染金黃色葡萄球菌克林霉素耐藥與分子流行病學研究*

基金項目:陜西省自然科學基金資助項目(2014JM4188)。

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血流感染金黃色葡萄球菌克林霉素耐藥與分子流行病學研究*

*基金項目:陜西省自然科學基金資助項目(2014JM4188)。

周珊1，張蓓2，徐修禮1△，馮琳涵1，劉家云1，馬越云1，郝曉柯1

(1.第四軍醫大學西京醫院全軍臨床檢驗醫學研究所,陜西西安 710032；

2.西安交通大學附屬西安市紅十字會醫院檢驗科，陜西西安 710054)

摘要:目的了解2014年全院血流感染金黃色葡萄球菌紅霉素對克林霉素誘導耐藥基因情況及分子流行病學分析。方法收集2014年全年臨床血液標本分離的金黃色葡萄球菌。以雙紙片法篩選紅霉素對克林霉素誘導耐藥的表型。erm基因檢測采用PCR方法，并用spa及多位點序列分型(MLST)方法了解不同erm型分子流行情況。結果33株金黃色葡萄球菌中MRSA分離率78.79%。且MRSA均攜帶有ermA基因。在7株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)中，4株分別攜帶ermB或ermC基因。spa及MLST結果顯示，該院血流感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以ST239-t030型別為主；而MSSA存在較多型別，如ST59-t437、ST398-t3625等。結論MRSA有較高分離率，主要以ST239-t030克隆株為主。erm基因主要以ermA檢出為主(86.67%)。菌株對抗菌藥物耐藥明顯，實驗室應加強對克林霉素誘導耐藥的檢測，以指導臨床合理使用抗菌藥物。

關鍵詞:血流感染；金黃色葡萄球菌；erm基因；流行病學；耐藥性

金黃色葡萄球菌是引起醫院和社區化膿性感染的主要病原菌。特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的感染，已經成為引起醫院內感染首要的病原菌[1]，尤其是MRSA引起的血流感染。由于MRSA往往呈現多重耐藥、治療困難、病死率高等特點，更是受到臨床及科研的廣泛關注。在臨床抗感染治療中，克林霉素由于其較強組織滲透性及低廉價格等優點，使其成為治療金黃色葡萄球菌感染中對青霉素過敏患者的首選藥物[2]。因此，了解黃色葡萄球菌對克林霉素耐藥機制，正確檢測及解讀克林霉素體外藥敏試驗至關重要。

本研究對2014年臨床分離的血流感染患者33株金黃色葡萄球菌進行鑒定及藥敏試驗,用頭孢西丁紙片擴散法判讀MRSA，以雙紙片法(D實驗)篩選紅霉素對克林霉素誘導耐藥表型，PCR方法檢測克林霉素誘導耐藥erm基因，并聯合spa及多位點序列分型(MLST)方法以了解不同erm型分子流行情況。為臨床合理使用抗菌藥物及院內控制提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料收集2014年全年血培養標本分離的金黃色葡萄球菌33株；質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.2儀器與試劑培養基及藥敏紙片購于英國OXOID公司，PCR反應試劑和溶葡萄球菌酶購于上海生工生物公司，DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，全自動細菌藥敏鑒定分析儀phoenix-100、基因擴增儀、電泳儀等購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗方法采用K-B紙片法和phoenix-100全自動細菌鑒定分析儀，按CLSI2014規定的標準進行[3]。

1.3.2耐甲氧西林葡萄球菌確定以頭孢西丁紙片法及phoenix-100全自動細菌鑒定分析儀聯合檢測，參照CLSI2014規定的判定標準進行[3]。

1.3.3紅霉素對克林霉素誘導耐藥表型確定根據CLSI2014推薦標準，在距離紅霉素紙片(15 μg/片)20 mm處貼含有克林霉素的紙片(2 μg/片)，35 ℃孵育16～18 h,克林霉素抑菌環在近紅霉素一側縮小或出現截平現象，即呈“D”形，則說明存在誘導性克林霉素耐藥，D試驗陽性。

1.3.4金黃色葡萄球菌全基因組DNA提取依據德國Qiagen公司的基因提取試劑盒進行細菌全基因組提取，最后用100 μL Elution Buffer將DNA洗脫。用eppendorf的Biophotometer plus測定基因組DNA純度及濃度后放-80 ℃冰箱備用。

1.3.5erm基因檢測根據金黃色葡萄球菌erm基因序列分別設計ermA、ermB及ermC引物，并由上海生工公司合成。以提取的金黃色葡萄球菌基因組為模板在退火溫度55 ℃下進行PCR，產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.6spa分型基于金黃色葡萄球菌A蛋白基因X區呈現多態性，建立spa分型方法[4]。在退火溫度為60 ℃的條件下進行PCR操作。產物送上海生物工程公司測序，測序后結果在該網站進行比對分析。

1.3.7MLST分型依據金黃色葡萄球菌7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)不同，對細菌進行分型。PCR反應引物及反應體系參考文獻[5]。PCR產物測序后，進行比對確定ST型別。

1.4統計學處理耐藥數據采用WHONET5.6軟件進行數據分析。

2結果

2.1藥敏及表型確認試驗33株金黃色葡萄球菌，頭孢西丁耐藥菌株26株，故MRSA為26株，占78.79%。33株細菌中有3株為紅霉素和克林霉素全敏感菌株，其他30株金黃色葡萄球菌均對紅霉素和克林霉素同時耐藥。對克林霉素耐藥形式存在誘導型耐藥(即D實驗陽性)和結構型耐藥(見圖1)，誘導耐藥為13株，占克林霉素耐藥菌的43.33%，結構耐藥17株，占56.67%。

A:結構型耐藥；B:誘導型耐藥。

圖1金黃色葡萄球菌對克林霉素耐藥表型

2.2erm基因檢測結果33株金黃色葡萄球菌中，30株細菌均攜帶有erm基因，攜帶率為90.91%(30/33)。攜帶ermA基因的為26株，占檢出erm基因的86.67%(26/30)，僅3株菌攜帶ermB基因，占10%(3/30)，7株菌攜帶ermC基因，占23.33%(7/30)。同時攜帶ermA和ermC基因有6株細菌，占20%(6/30)，僅有1株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)只攜帶ermC基因。菌株erm基因分型結果見圖1。

M:DNA標志物；1:ermA (共20株);2:ermB(共3株);3:ermC(共1株);4:ermA+ermC(共6株);5:未檢出erm基因(共3株)。

圖233株菌erm基因分型結果

2.3菌株spa及MLST分型結果spa分型結果顯示，33株金黃色葡萄球菌共存在8個spa型別，spa分型PCR產物見圖2，相對分子質量在300 bp左右。其中t030為24株占72.73%，為主要型別。其他型別還有t437(2株占6.06%)、t037(2株占6.06%)、t002、t3625、t2092、t091、t1793各1株。對7個管家基因(gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta)進行PCR，產物測序比對后顯示，共存在6個ST型別：ST239(26株占78.79%)；ST59、ST398均為2株(占6.06%)；ST121、ST7、ST5均為1株。并且所有的MRSA均為MST-ST239型別。

M:DNA標志物；1:spa-t030;2:spa-t2092;3:spa-t1793;4:spa-t037;5:spa-t3625;6:spa-t437;7:spa-t091;8:spa-t002。

圖3不同spa型別PCR反應產物

2.4erm基因在不同型別菌株中分布菌株分子型別與erm基因攜帶及耐藥數據分析見表1。從數據中可以看出，在33株血流感染金黃色葡萄球菌中，MRSA菌株26株，同時所有MRSA菌株均為ST239型別。依據spa和MLST聯合分型來看，MRSA菌株除2株細菌為ST239-t037，其他24株菌均為ST239-t030。ermA基因只在MRSA菌株中檢出。且紅霉素誘導克林霉素耐藥表型共13株，均攜帶ermA基因。結構性耐藥表型攜帶erm基因種類較多。其中有6株結構型耐藥細菌同時攜帶ermA和ermC基因。

表1　　erm基因在不同型別菌株中的分布情況

續表1　　erm基因在不同型別菌株中的分布情況

3討論

金黃色葡萄球菌是引起各種重癥感染的主要病原菌之一[6]，近年來由于抗菌藥物的不合理使用，使MRSA的檢出率逐年增加并呈現多藥耐藥的趨勢[7]。并且統計數據顯示MRSA耐藥率明顯高于MSSA[7]。MRSA不僅僅對β-內酰胺類、酶抑制劑復合抗菌藥物及碳青霉烯類耐藥，大部分同時對大環內酯類，林可霉素類，喹諾酮類等均有較高耐藥率[7]。眾所周知，金黃色葡萄球菌引起的血流感染，患者病情兇險，治療難度大[8]。所以MRSA血流感染的治療相當棘手。并且數據資料顯示臨床分離自血流感染的金黃色葡萄球菌對紅霉素和克林霉素的耐藥率均大于50%[8]。因此，了解金黃色葡萄球菌對紅霉素和克林霉素耐藥產生機制，對感染預防治療極其重要。

金黃色葡萄球菌對紅霉素和克林霉素的耐藥機制主要有兩種，一種是能量依賴的主動泵出機制，一種是由erm基因編碼導致23SrRNA甲基化，通過降低藥物對核糖體的結合而產生的耐藥。erm基因介導的耐藥，在表型上分為兩種，即誘導型耐藥和結構型耐藥[9]。

本研究數據顯示，本院2014年臨床分離血流感染金黃色葡萄球菌患者共33株，MRSA分離率為78.79%，且所有MRSA菌株均為ST239并檢出ermA基因。說明ermA基因主要存在于MRSA中。與文獻報道不同[8-9]，ermB僅在3株MSSA結構型耐藥菌株中檢出，同時只有1株MSSA菌株檢出只攜帶ermC基因，單獨攜帶ermB或者ermC基因檢出率較低。在誘導型耐藥菌株中，只檢出ermA基因。這些現象可能與地域分布存在密切關系[10]。

從紅霉素和克林霉素耐藥上來看，33株金黃色葡萄球菌中30株細菌存在耐藥，耐藥率高達90.91%，且誘導型耐藥表型占相當比例(43.33%)。證明本院紅霉素和克林霉素耐藥現象比較嚴重。但由于目前微生物自動化鑒定及藥敏儀器的逐步普及，大部分三甲醫院已不再用克林霉素紙片法檢測藥敏，而是直接通過自動化儀器的微量稀釋法報告MIC結果。這使得誘導型克林霉素耐藥菌株出現漏檢現象，可能會導致臨床治療的失敗。所以，提倡實驗室在自動化儀器鑒定藥敏時，能夠采用D試驗檢測誘導型耐藥表型。該方法簡單易行，適合臨床實驗室推廣。

從分子表型上來看，13株誘導型耐藥菌均為ST239-t030型MRSA菌株，并且全部攜帶ermA一種耐藥基因。而17株結構型耐藥菌株攜帶的erm基因型別較多。此數據說明，在本院紅霉素克林霉素誘導型耐藥主要由ermA基因所致，且該菌株型別為ST239-t030型MRSA。同時證明該型別菌株存在克隆傳播現象，因此，臨床感染工作人員應加強生物安全觀念，提高耐藥菌株檢出率，及時采取有效的控制措施，有效防止耐藥菌株產生及傳播。

參考文獻

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本刊聲明

《國際檢驗醫學雜志》2015年36卷第8期刊發文章《胰島素泵聯合諾和靈30R治療糖尿病合并肺部感染的療效及檢驗指標分析》一文，通訊作者為王瑩，電子郵箱：150476755@qq.com。

《國際檢驗醫學雜志》編輯部

2015-12-30

·論著·

Study on clindamycin resistance and molecular epidemiology of bloodstream infection by Staphylococcus aureus*

ZhouShan1,ZhangBei2,XuXiuli1△,FengLinhan1,LiuJiayun1,MaYueyun1,HaoXiaoke1

(1.PLAResearchInstituteofClinicalLaboratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedical

University,Xi′an,Shaanxi710032,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,Affiliated

Xi′anRedCrossHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710054,China)

Abstract:ObjectiveTo understand the clindamycin resistance gene and molecular epidemic of Staphylococcus aureus in the patients with bloodstream infection in our hospital during 2014.MethodsThe clinical isolates of Staphylococcus aureus in clinical bloodstream infection were collected during 2014.The phenotype of erythromycin to clindamycin induced resistance was assessed by D test.The erm gene was detected by PCR.The different erm types of the molecular epidemiology of Staphylococcus aureus were studied by spa and MLST typing.ResultsIn 33 strains of Staphylococcus aureus,the isolation rate of MRSA strains were 78.79%,moreover all of MRSA strains carried ermA gene.In 7 strains of methicillin sensitive Staphylococcus aureus(MSSA),4 strains respectively carried ermB or ermC gene.The results of MLST and spa results showed that the main type of MRSA in our hospital was ST239-t030.But MSSA had more types,such as ST59-t437,ST398-t3625 and so on.ConclusionMRSA has higher isolation rate in our hospital,which is dominated by ST239-t030 type.For the detection of gene erm,ermA (86.67%) is the main type.The strains are obviously resistant to antibacterial drugs.The laboratory should strengthen the detection of clindamycin induced resistance for guiding the clinical rational use of antibacterial drugs.

Key words:bloodstream infection;Staphylococcus aureus;erm gene;epidemiology;drug resistance

收稿日期：(2015-08-02)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.004A

文章編號：1673-4130(2015)24-3517-03

通訊作者△,Email:xxlxxl@fmmu.edu.cn。

作者簡介：周珊，女，主管檢驗技師，主要從事微生物診斷及耐藥機制研究。