HPLC-DAD同時測定金蟬花中8種核苷類成分的含量

2016-01-31 01:07:53呂慧慧楊安倫

實用藥物與臨床 2015年12期

呂慧慧，楊安倫，張　浩

呂慧慧1*，楊安倫1，張浩2

[摘要]目的建立同時測定金蟬花中腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分的HPLC測定方法。方法采用Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，流動相：甲醇-水梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。結果腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分分別在0.081~1.62、0.074~1.48、0.098~1.85、0.068~1.36、0.071~1.42、0.051~1.01、0.058~1.16、0.068~1.34 μg內呈良好的線性關系(R2≥0.999 0)，平均加樣回收率分別為97.8%、98.3%、101.5%、98.9%、99.1%、97.3%、100.6%、98.9%，RSD<3.00%。結論該方法簡單、重現性良好，準確可靠，可用于金蟬花藥材的快速質量評價。

[關鍵詞]金蟬花；核苷類成分；HPLC

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of 8 nucleosides (Adenine,Cytosine,Inosine,Uracil,Uridine,β-thymidine,Adenosine and 2’-deoxyadenosine) from cordyceps cicadae.MethodsThe analysis was achieved with an Inertsil ODS-SP Extend C18column (250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of methanol and water at 25 ℃.The flow rate was 1 mL/min,injection volume was 10 μL,and detection wavelength was set at 260 nm.ResultsAll the active constituents′ calibration curves showed a good linearity (R2≥0.999 0) in a relatively wide concentration range.The liner range of the active constituents was 0.081~1.62,0.074~1.48,0.098~1.85,0.068~1.36,0.071~1.42,0.051~1.01,0.058~1.16,0.068~1.34 μg,respectively.The average recovery rate was 97.8%,98.3%,101.5%,98.9%,99.1%,97.3%,100.6%,98.9%,RSD<3.00%.ConclusionThis method is simple with good reproducibility,accuracy and reliability,it can be used for the rapid quality evaluation of cordyceps cicadae.

收稿日期：2015-06-17

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512019

HPLC-DAD method for simultaneous determination of 8 nucleosides in cordyceps cicadaeLü Hui-hui1*,YANG An-lun1,ZHANG Hao2(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310018,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Key words：Cordyceps cicadae;Nucleosides;HPLC

0引言

金蟬花[1](Cordyceps cicadae)為麥角菌科真菌大蟬草(Cordyceps cicadae Shing)寄生于蟬科昆蟲的若蟲上形成的蟲菌復合體，又名蟬花、蟬茸、蟲花、蟬蟲草、蟬茸菌，其性味甘寒，具散風熱、定驚鎮痙、明目之功效，屬于蟲草類藥材，主產于浙江、四川等地。金蟬花含有豐富的生物活性成分，如多種生物堿、多糖[2]、核苷類成分[3-4]、蟲草酸、多種必需氨基酸[5]等有效成分?，F代藥理研究表明，金蟬花具有改善腎功能[6]、治療糖尿病[7]、抗失血性貧血、調解機體免疫功能等臨床療效。核苷類成分是金蟬花中重要的生物活性物質，既參與胞內遺傳物質的合成，又與蛋白質表達及細胞的分裂增殖有關[8]。腺嘌呤參與遺傳物質的合成，能促進白細胞增生，用于防治各種原因引起的白細胞減少癥，特別是用于腫瘤化學治療時引起的白細胞減少癥，也用于急性粒細胞減少癥[9]。胞嘧啶是一種重要的醫藥中間體，常用于抗艾滋病、慢性乙型肝炎和腫瘤藥物的合成[10]。肌苷為輔酶類藥物，能參與體內能量代謝及蛋白質合成，具有提高各種酶特別是輔酶Ade 活性、改善抗體代謝作用。尿嘧啶干擾病毒DNA、RNA的復制，抑制病毒增殖，保護細胞免受病毒損害[11]。尿苷有助于提高細胞的耐缺氧能力，并能促進蛋白質、核酸的生物合成，阻斷癌細胞和病毒基因合成[12]。β-胸苷是核苷類物質的重要組成部分，也是抗艾滋病藥物齊多夫定的合成原料。腺苷是機體內重要的生物活性物質，廣泛存在于細胞內液和細胞外液中，在機體的中樞神經、心血管系統、凝血系統等發揮重要作用[13]。2-脫氧腺苷(dAR)是天然的脫氧核苷，具有一定的藥用價值，可抑制胰島素分泌。近年來dAR作為一種合成抗腫瘤、抗病毒核苷類化合物的中間體受到越來越高的關注。

基于金蟬花中核苷類成分種類豐富，療效顯著，本實驗對金蟬花中8種核苷類成分含量進行測定，為金蟬花的質量控制提供數據支持。

1儀器與試藥

1.1儀器UltiMate 3000戴安液相色譜儀，包括真空脫氣泵、四元泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD二極管陣列檢測器；KS-80中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；BP210S十萬分之一電子天平(Sartorius公司)；數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱。

1.2試藥金蟬花(批號：20140501，產地：杭州，購自浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司)；腺嘌呤(批號：1108886-201102，100%，中國藥品生物制品檢定所)、胞嘧啶(C19895，99%，西亞試劑)、肌苷(140669-201305，100%，中國藥品生物制品檢定所)、尿嘧啶(100469-201312，99.6%，中國藥品生物制品檢定所)、尿苷(887-200202，100%，中國藥品生物制品檢定所)、β-胸苷(13650，99%，西亞試劑)、腺苷(110879-200202，中國藥品生物制品檢定所)、2-脫氧腺苷(U3874，98%，西亞試劑)；無水乙醇為分析純，流動相甲醇為色譜純，水為純凈水。

2方法與結果

2.1波長的選擇用UltiMate 3000 DAD檢測器對腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷在180~420 nm波段進行掃描，結果表明，選用260 nm為檢測波長較為理想。

圖1核苷類成分對照品和金蟬花樣品色譜圖

注：A.核苷類成分對照品，B.金蟬花藥材；1.腺嘌呤，2.胞嘧啶，3.肌苷，4.尿嘧啶，5.尿苷，6.β-胸苷，7.腺苷，8.2-脫氧腺苷

2.2色譜條件以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)為色譜柱。甲醇為流動相A，水為流動相B。梯度洗脫：0~10 min，1%~5%A；10~15 min，5%~15% A；15~20 min，15%~20% A；20~30 min，20% A；30~35 min，20%~35% A；35~40 min，35%~1% A。柱溫25 ℃，流速1 mL/min，檢測波長260 nm。見圖1。

2.3對照品溶液的制備精密稱取對照品腺嘌呤3.24 mg、胞嘧啶2.96 mg、肌苷3.90 mg、尿嘧啶2.72 mg、尿苷2.84 mg、β-胸苷2.02 mg、腺苷2.32 mg、2-脫氧腺苷2.68 mg分別置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液依次稀釋成相應對照品溶液，濃度：腺嘌呤8.1、16.2、32.4、81.0、162.0 μg/mL，胞嘧啶7.4、14.8、29.6、74.0、148.0 μg/mL，肌苷9.75、19.5、39.0、97.5、195.0 μg/mL，尿嘧啶6.8、13.6、27.2、68.0、136.0 μg/mL，尿苷7.1、14.2、28.4、56.8、71.0、142.0 μg/mL，β-胸苷5.05、10.1、20.2、50.5、101.0 μg/mL，腺苷5.8、11.6、23.2、58.0、116.0 μg/mL，2-脫氧腺苷6.8、13.4、26.8、68.0、134 μg/mL，進行測定。

2.4供試品溶液的制備稱取金蟬花粉末(過三號篩)約0.2 g置具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇溶液25 mL，超聲提取30 min，取續濾液，過膜純化，取供試品液10 μL，注入色譜儀，測定，即得。

2.5線性關系考察將對照品儲備液加甲醇稀釋2、5、10、20倍制成對照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標、8種核苷類對照品進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，見表1。

表1　8種核苷類成分線性關系考察結果

結果表明，腺嘌呤在線性范圍0.081~1.62 μg、胞嘧啶在線性范圍0.074~1.48 μg、肌苷在線性范圍0.098~1.95 μg、尿嘧啶在線性范圍0.068~1.36 μg、尿苷在線性范圍0.071~1.42 μg、β-胸苷在線性范圍0.051~1.01 μg、腺苷在線性范圍0.058~1.16 μg、2-脫氧腺苷在線性范圍0.068~1.34 μg內呈良好的線性關系，符合試驗要求。

2.6精密度考察取對照品溶液腺嘌呤32.4 μg/mL、胞嘧啶29.6 μg/mL、肌苷39.0 μg/mL、尿嘧啶27.2 μg/mL、尿苷28.4 μg/mL、β-胸苷20.2 μg/mL、腺苷23.2 μg/mL、2-脫氧腺苷26.8 μg/mL，按上述色譜條件進行進樣分析，進樣6次，每次10 μL，測定峰面積，并計算RSD分別為腺嘌呤1.58%、胞嘧啶1.17%、肌苷0.86%、尿嘧啶1.94%、尿苷1.28%、β-胸苷1.73%、腺苷0.97%、2-脫氧腺苷1.55%，表明儀器精密度符合試驗要求。

2.7加樣回收試驗取已知含量金蟬花粉末(過三號篩) 0.2 g共6份，分別加入濃度為腺嘌呤32.4 μg/mL、胞嘧啶74.0 μg/mL、肌苷195.0 μg/mL、尿嘧啶68.0 μg/mL、尿苷28.4 μg/mL、β-胸苷20.2 μg/mL、腺苷58.0 μg/mL、2-脫氧腺苷13.4 μg/mL的對照品溶液1 mL，依照上述供試品制備方法及色譜條件制樣、測定，并計算回收率、RSD值分別為：腺嘌呤97.8%、2.46%，胞嘧啶98.3%、1.72%，肌苷101.5%、1.04%，尿嘧啶98.9%、2.04%，尿苷99.1%、1.85%，β-胸苷97.3%、2.12%，腺苷100.6%、1.82%，2-脫氧腺苷98.9%、2.83%，結果表明，準確度符合試驗要求。

2.8重復性考察取金蟬花粉末(過三號篩)按照上述供試品溶液制備方式平行制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL，注入色譜儀，測定并計算。結果樣品中腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷、2-脫氧腺苷的平均含量分別為59.08、352.66、1 407.92、319.47、71.23、86.73、467.09、30.39 μg/g、RSD分別為2.37%、1.78%、1.24%、2.12%、2.51%，1.96%、2.09%、2.76%，重復性符合試驗要求。

2.9穩定性考察取金蟬花供試品溶液分別于0、5、10、15、20、25、30 h進樣，測定腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷、2-脫氧腺苷峰面積值，計算RSD值分別為1.27%、1.84%、0.96%、1.44%、1.73%、1.14%、0.89%、1.92%，表明供試品溶液中核苷類成分在30 h內穩定。

3樣品測定

3.1試驗樣品金蟬花藥材分別收購自浙江杭州、臺州、安徽亳州、四川成都、江蘇常州、江西九江，經浙江中醫藥大學來平凡教授鑒定，為麥角菌科真菌蟬擬青霉寄生于蟬蛹上的干燥復合體。

3.2含量測定取金蟬花粉末(過三號篩)，按上述供試品制備方法制備金蟬花供試液，精密取供試品溶液10 μL，分別進樣，記錄峰面積，外標定量測得各批次中核苷類成分的含量，結果見表2。

表2　各批次金蟬花核苷類成分含量測定結果(μg/g)

4討論

4.1檢測方法的確定本試驗分別對標準品和供試品的線性范圍、精密度、準確度、穩定性和重復性進行考察。結果表明，腺嘌呤、胞嘧啶、肌苷、尿嘧啶、尿苷、β-胸苷、腺苷和2-脫氧腺苷8種核苷類成分在相應范圍內呈現良好的線性關系(R2≥0.999 0)。加樣回收試驗顯示準確度較高。說明該條件適合對金蟬花核苷類成分進行檢測評價。

4.2不同產地金蟬花的比較通過對不同產地金蟬花核苷類成分比較分析，可知不同產地金蟬花核苷類物質組成以及相同物質之間的含量有明顯差異，該研究為評價金蟬花質量差異提供依據。

4.3金蟬花的藥用前景中醫認為，金蟬花是一種功效與冬蟲夏草近似的珍貴藥材，具有多方面的藥用價值。但相較于冬蟲夏草對生長環境的要求高、產量少、價格昂貴，金蟬花價格相對低廉，生態要求相對較低，因此可大力開發金蟬花作為冬蟲夏草的代用品。

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