α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌細胞增殖的機制研究

侯培鋒，陳　強（福建醫科大學干細胞醫學研究院，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福建醫科大學附屬協和醫院腫瘤內科，福建福州　350001）

α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌細胞增殖的機制研究

侯培鋒，陳強
（福建醫科大學干細胞醫學研究院，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福建醫科大學附屬協和醫院腫瘤內科，福建福州350001）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.058.html

α-酮戊二酸二甲酯（DM-2KG）是目前在基礎研究中廣泛被應用為養料來營救因營養缺失導致的細胞生長抑制［1］。據報道，在多種代謝酶發生突變如IDH1或SDH突變的腫瘤細胞中，當應用DM-2KG干預后，這類代謝物進入細胞后即可轉化為PHD活化的輔助因子α-KG，激活PHD酶活性，促進缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白降解［2］，即HIF-1α蛋白的PHD經典降解途徑。

在常氧且營養成分充足的條件下，DM-2KG不僅沒有促進癌細胞的生長，反而抑制癌細胞的生長，并能誘導產生一組干細胞樣的癌細胞［3］。本文深入探討其中的發生機制。

1　材料與方法

1.1材料DM-2KG、去鐵胺、二甲基草酰甘氨酸和環己酰亞胺（Sigma公司）；MG132（Calbiochem公司）。其他：HIF-1α（BD Bioscience），HIF-2α（Novus Biologicals），anti-Actin（Millipore），anti-CD44（Cell Signaling），anti-Ki67（Abcam），Hoechst 33342（Sigma），Image-Pro6.3軟件（Media Cybernetics），Gallios流式細胞儀（Beckman），TD-20e光度計（Turner）。

1.2方法采用無目標基因的shRNA轉染MDA-MB-231細胞作為對照和針對HIF-1α的shRNA-沉默MDA-MB-231細胞（MDA-MB-231/shHIF-1α）。采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Cell Signaling）檢測細胞衰老狀況。根據產品使用指南用ENLITEN? ATP Assay System（Promega，FF2000）測定ATP產量。采用免疫熒光染色和流式細胞術檢測細胞表面的CD44標志物；免疫熒光染色和成像技術檢測細胞總CD44標志物。采用乳腺細胞球形成試驗評估癌細胞致瘤能力。

2　結果

2.1DM-2KG抑制乳腺癌細胞生長經DM-2KG培養至10 d，DM-2KG明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖及細胞內ATP生成，也可抑制乳腺癌細胞株MCF7的集落生成大小和數量。MDA-MB-231細胞除癌細胞集落生成受抑制外，癌細胞的形態出現明顯的肥大。將獲取的生長抑制的癌細胞集落在沒有DM-2KG的培養液中重新培養10 d，癌細胞恢復了增殖和細胞集落形成能力。采用與衰老相關的β-半乳糖苷酶試驗也證實所獲取的生長抑制的癌細胞并非衰老細胞，提示DM-2KG誘導的具備增殖可逆性的生長停滯癌細胞是一靜止休眠期細胞亞群。在營養成分充足的培養液中，DM-2KG對癌細胞的生長起抑制作用。

2.2DM-2KG誘導乳腺癌細胞高表達CD44采用Ki67low和Hochest 33342low雙染法來標記靜止休眠期細胞（G0細胞）。MDA-MB-231細胞經DM-2KG干預4 d后，和對照組比較，G0細胞的比例從12.7% 增大到24.5%，干預7 d，比例增至31.3%。在MCF7細胞觀察到相似結果（28.3%vs 45.3%）。可見，乳腺癌細胞經DM-2KG干預后可促進癌細胞向G0靜止休眠期細胞轉化。并且MDA-MB-231細胞表面表達的CD44水平增加呈時間依賴性趨勢。同樣在MCF7細胞，DM-2KG也可誘導癌細胞表面CD44高表達。可見DM-2KG可抑制乳腺癌細胞的增殖，并誘導產生一群細胞大小增大、細胞表面高表達腫瘤干細胞標志物CD44的靜止休眠期細胞。

2.3DM-2KG誘發乳腺癌細胞靜止休眠狀態和干細胞樣表型是HIF-1α介導驗證MDA-MB-231/shHIF-1α細胞HIF-1α的敲減效率，采用兩株經shRNA干預過的MDA-MB-231細胞進行干預。經DM-2KG干預7 d后，MDA-MB-231/ shCON細胞和MDA-MB-231/shHIF-1α細胞相比，前者可明顯獲取更多的靜止休眠亞群癌細胞。DM-2KG明顯增加了MDA-MB-231/shCON細胞總 CD44蛋白的表達，而對于MDA-MB-231/shHIF-1α細胞，DM-2KG干預前后，總 CD44蛋白水平基本沒有太大改變，提示DM-2KG上調乳腺癌細胞高表達 CD44是受HIF-1α介導的。可見，HIF-1α在DM-2KG誘發干細胞樣癌細胞的過程中發揮重要作用。

3　討論

乳腺癌治療過程中常出現耐藥情況，導致多療程化療后療效變差，對信號通路的研究成為耐藥機制研究的一大熱點［4］。本研究證實常氧條件下，DM-2KG作用于乳腺癌細胞后會使細胞出現假缺氧反應，并誘發癌細胞出現兩個結局：①DM-2KG抑制乳腺癌細胞的生長，誘發一亞組處于靜止期的癌細胞；②DM-2KG誘發一腫瘤干細胞樣的癌細胞亞群，該亞群癌細胞具有自我更新，高致瘤能力等的特點。HIF-1α蓄積會導致乳腺癌細胞增殖停滯，DM-2KG不僅可以調控乳腺癌細胞向干細胞樣癌細胞轉化，而且通過其誘導產生的HIF-1α使一群乳腺癌細胞轉化成干細胞樣癌細胞狀態，而且這群癌細胞具備有強致瘤能力和高腫瘤增殖力。推測DM-2KG通過HIF-1α誘發產生的靜止期癌細胞可能是乳腺癌細胞向干細胞樣癌細胞轉化過程中的一個重要條件。代謝物DM-2KG可以通過調節HIF-1α的蛋白水平而誘導產生干細胞樣癌細胞。

［1］Lin T C，Chen Y R，Kensicki E，et al.Autophagy：resetting glutamine-dependent metabolism and oxygen consumption［J］.Autophagy，2012，8（10）：1477-93.

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［3］Hou P，Kuo C Y，Cheng C T，et al.Intermediary metabolite precursor dimethyl-2-ketoglutarate stabilizes hypoxia-inducible factor-1α by inhibiting prolyl-4-hydroxylase PHD2.［J］.PLoS One，2014，9（11）：113865.

［4］ 張梅，袁霞，徐波，等.蛋白酶體抑制劑YSYO1A不依賴NF-κB通路抑制乳腺癌細胞增殖及誘導凋亡研究［J］.中國藥理學通報，2014，30（3）：330-5.

［4］Zhang M，Yuan X，Xu B，et al.YSY01A as the NF-κB-independent proteasome inhibitor inhibits proliferation and induces apoptosis in breast cancer cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30 （3）：30-5.

Mechanism of inhibition of breast cancer cell proliferation by α-dimethyl 2-oxoglutarate

HOU Pei-feng，CHEN Qiang

（Stem Cell Institute for Medical Research of Fujian Medical University，Key Laboratory of Tumor of Translational Medicine of Fujian Province，Dept of Medical Oncology，Fujian Union Hospital，Fuzhou350001，China）

α-酮戊二酸類似物；缺氧誘導因子-1α；靜止期細胞；乳腺癌干細胞；脯氨酰羥化酶2；靶點

DM-2KG；HIF-1α；quiescent cell；breast cancer stem cell；PHD2；target

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.029

A文章編號：1001-1978（2016）05-0738-02中國圖書分類號：R329.24；R737.902.2；R916.4

2016-02-15，

2016-03-21

福建省衛計委醫學創新項目（No 2015-CXB-15）

侯培鋒（1976-），男，博士，副主任醫師，研究方向：腫瘤基礎與臨床，E-mail：peifenghou@sina.com