丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認知功能及其對海馬區GAP-43和突觸素表達的影響

陳慶友　師　巖　王中華

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科，黑龍江　齊齊哈爾　161000)

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丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認知功能及其對海馬區GAP-43和突觸素表達的影響

陳慶友師巖1王中華2

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科，黑龍江齊齊哈爾161000)

〔摘要〕目的探討丁苯酞對血管性癡呆(VD)大鼠認知功能及對海馬區GAP-43和突觸素P38表達的影響。方法選取雄性Wistar大鼠90只，隨機分為觀察組、對照組、空白組各30只。空白組不采取任何操作；對照組大鼠制成VD模型，并予以生理鹽水；觀察組大鼠制成VD模型后，予以丁苯肽注射液。治療1個月后，采取MG-Y-型迷宮檢測其認知功能以及采用Western印跡和RT-PCR分別檢測大鼠海馬區內GAP-43和突觸素P38的表達。結果觀察組和空白組大鼠的錯誤反應次數均明顯低于對照組(P均<0.05)，且空白組大鼠降低更明顯(P<0.05)。對照組和觀察組的GAP-43在大鼠海馬區內的mRNA中表達較空白組高(P均<0.05)，且觀察組表達程度較對照組更高(P<0.05)；觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區內的mRNA中表達較空白組和對照組均提高(P均<0.05)，而對照組和空白組之間表達無差異(P>0.05)；觀察組GAP-43在大鼠海馬區內的蛋白中表達較對照組和空白組均提高(P均<0.05)，對照組和空白組之間表達無差異(P>0.05)；對照組和觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區內的蛋白中表達較空白組均提高(P均<0.05)，且觀察組表達程度較對照組更高(P<0.05)。結論對于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治療，其可促進神經元的修復及再生，改善VD大鼠海馬區GAP-43及突觸素P38的表達，從而提供其認知功能，改善其預后。

〔關鍵詞〕丁苯酞；血管性癡呆；認知功能；GAP-43；突觸素P38

血管性癡呆(VD)的發病率近年來持續上升，現已成為中老年人常見病之一，在我國其患病率已達2.1%～3.5%〔1，2〕。而目前針對VD的治療方法主要是通過促進腦部微循環，改善血液灌注等對癥治療。丁苯酞注射液可以改善腦卒中患者的中樞神經系統損傷以及腦能量代謝和腦缺血區的微循環。但關于丁苯酞注射液是否可以改善VD患者癥狀的報道仍不多。本研究旨在探討丁苯酞對VD大鼠認知功能及對海馬區GAP-43和突觸素P38表達的影響。

1材料與方法

1.1動物及分組普通級健康成年雄性SD大鼠90只(哈爾濱醫科大學實驗動物中心)，平均體重為(300.2±50.2)g，平均鼠齡(14.32±2.57)w。大鼠分籠飼養，正常光照，自由飲水和攝食，溫度22℃，相對濕度50%～70%。將其隨機分為觀察組、對照組、空白組各30只。空白組不采取任何操作；對照組大鼠制成VD模型，并予以生理鹽水；觀察組大鼠制成VD模型后，予以丁苯酞注射液。

1.2試劑和儀器丁苯酞注射液(國藥準字 p0100041，石藥集團恩必普藥業有限公司)，2次/d，150 ml/次，每次靜注不少于1 h，兩次用藥時間間隔≥6 h，且只能使用PE輸液器；GAP-43多克隆抗體(規格：0.2 ml，濃度1 mg/ml，上海安研生物有限公司)；突觸素P38多克隆抗體(規格：0.2 ml，濃度1 mg/ml，上海華研生物有限公司)，SDS-PAGE試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)，Trizol 試劑盒(西安融智生物技術有限公司)、引物(上海喬羽生物科技有限公司)，MG-Y-型迷宮試驗裝置(安徽正華生物儀器設備有限公司)。

1.3制備VD模型本研究通過結扎頸總動脈的方法來制作VD大鼠模型。具體操作方法為：觀察組大鼠于術前6～8 h禁食水，首先麻醉SD大鼠，向大鼠腹腔內按照400 mg/kg的劑量注射10%水合氯醛。待麻醉成功后，用大頭針固定大鼠的四肢，使其成仰臥位。去除大鼠頸部的毛發，向上至下頜部，向下至鎖骨，兩側至胸鎖乳突肌外援2 cm處。先用碘伏消毒，其消毒范圍大于去毛范圍，而后用酒精擦拭干凈。沿氣管中線切約5 cm的切口，依次分離皮膚、軟組織、肌肉直至顯露兩側頸總動脈。分離過程中應小心操作，小心誤傷迷走神經，用4-0 Dexon線分別結扎兩側頸總動脈的近心端及遠心端，于其二者中間剪斷頸總動脈。逐層縫合，于皮膚傷口縫合處予以紅霉素預防感染。待大鼠狀態穩定，清醒后活動無異常，將其送回至籠中。術后30 d即制成VD模型。對照組大鼠手術方法與觀察組一致，區別為其只分離兩側頸總動脈。在制模的1個月內，三組大鼠所飼養的環境以及喂養食物均一致。經過1個月制備成模后，對照組大鼠予以注射生理鹽水，觀察組大鼠予以注射丁苯酚注射液，空白組大鼠不進行任何操作，按此方法治療1個月。

1.4采用MG-Y-型迷宮檢測認知功能在經過1個月的藥物治療后，采用MG-Y-型迷宮來檢測各組大鼠之間認知功能的差別。MG-Y-型迷宮是由3條等長的臂組成的三等分輻射式迷路箱及控制儀組成，當按下控制儀的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應的Ⅰ臂、Ⅱ臂、Ⅲ臂信號燈亮，對應的亮燈的臂即為安全區，沒有亮的臂以及交界處均為危險區〔3〕，在試驗中大鼠若在受到刺激后，一次性的跳躍至安全區的范圍，即記為一次正確反應，若大鼠未跳躍或者跳躍至危險區，則為錯誤反應。大鼠達標的標準為連續10次刺激中，大鼠有至少9次以上表現為正確反應。EN值即為大鼠達到達標標準之前的刺激次數。對于達標的大鼠，送其回籠休息18 h，而后記錄大鼠刺激10次中的正確反應次數，此值記為CN值。EN值一般代表大鼠的學習能力，而CN值代表大鼠的記憶能力，二者結合則體現大鼠的認知功能。所有入組的大鼠均由同一醫師在相同條件下進行檢測。

1.5采集標本及觀察指標的測量

1.5.1 采集標本在3組大鼠進行MG-Y-型迷宮后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，取出腦部組織，置于冰上，將海馬組織分離出來，保存于-196℃的液氮中。分別檢測三組大鼠海馬組織內mRNA和蛋白中的GAP-43、突觸素P38的含量，并加以比較。

1.5.2海馬組織內mRNA中的GAP-43，突觸素P38的檢測采用Trizol試劑盒提取3組大鼠海馬組織的總RNA，用RT-PCR的方法來測量其內的GAP-43、突觸素P38的含量。設計的引物為：GAP-43：正義：5′AGGGAGATGGCTCTGCTAC 3′，反義：5′GAGACAGGGTTCAGGTGGG 3′，產物463 bp；突觸素P38：正義：5′CAGCCGTGTTCGCTTTCA 3′，反義：5′TGCCCAGCCTGTCTCCTT 3′，產物為250 bp。RT-PCR的反應條件：98℃ 3 min，其之后的40個循環在98℃ 1 min，60℃ 1 min，75℃ 1.5 min的反應條件下進行，最后在75℃的條件下延伸10 min。記錄各產物的溶解時間，最后在PCR儀上繪制其溶解曲線。電泳后，測量GAP-43，突觸素P38與β-actin的相對灰度比值。

1.5.3海馬組織內蛋白中的GAP-43，突觸素P38的檢測液氮中將保存的海馬組織在4℃10 000 r/min離心10 min，取其上層清液，按照SDS-PAGE試劑盒的說明書進行分離操作，按照說明書標配的濃度進行凝膠的配置，用SDS-PAGE上樣緩沖液沸水浴加熱4 min后冷卻至室溫，而后進行電泳電壓設置為100 V，時間設定為100 min。將轉膜槽放置在冰水浴中進行轉膜，轉膜后放置到預先備好的Western洗滌液中封閉，經過抗體孵育后，測定Western印跡蛋白條帶積分光密度值。

1.6統計學方法采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析和SNK法。

2結果

2.1三組大鼠認知功能的對比三組大鼠經過MGY-型迷宮測試后，觀察組和空白組大鼠的錯誤反應次數〔(62.70±4.81)次，(49.50±5.19)次〕均明顯低于對照組〔(81.86±5.15)次〕(P均<0.05)，且空白組大鼠降低更明顯(P<0.05)；觀察組和空白組大鼠的正確反應次數〔(7.30±1.87)次，(8.30±1.41)次〕均明顯高于對照組〔(5.19±1.32)次〕(均P<0.05)。

2.2三組大鼠海馬組織GAP-43、突觸素P38 mRNA表達對照組和觀察組的GAP-43在大鼠海馬區內的mRNA中表達(1.11±0.04，1.57±0.03)較空白組(0.61±0.07)高(均P<0.05)，且觀察組表達程度較對照組更高(P<0.05)；觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區內的mRNA中表達(1.91±0.02)較空白組(0.64±0.04)和對照組(0.87±0.06)均提高(均P<0.05)，而對照組和空白組之間表達無差異(P>0.05)。

2.3三組大鼠海馬組織GAP-43，突觸素P38蛋白表達觀察組GAP-43在大鼠海馬區內的蛋白中表達(2.61±1.24)較對照組(2.19±1.05)和空白組(2.18±1.15)均提高(P均<0.05)，對照組和空白組之間表達無差異(P>0.05)。對照組和觀察組的突觸素P38在大鼠海馬區內的蛋白中表達(2.32±1.13，2.57±1.31)較空白組(2.70±1.14)均提高(P均<0.05)，且觀察組表達程度較對照組更高(P<0.05)。

3討論

VD多產生于腦卒中患者，這是由于其長期缺氧導致腦部血流灌溉不足，生成氧自由基及乳酸等物質，導致患者腦部神經元細胞被破壞，逐漸出現學習記憶能力下降，最終出現認知功能障礙，給家庭及社會帶來嚴重困擾〔4〕。本研究結果說明經過丁苯酚注射液治療的VD大鼠，其學習能力以及記憶能力得到提高，即其認知功能得到修復。

GAP-43是一種促進神經元修復與合成的軸突膜蛋白，曾作為首選的分子探針廣泛用于神經元細胞修復等方面的研究。曾有研究報道，在損傷的神經元進行修復的過程中，GAP-43的表達增強，合成速度加快，并且隨著GAP-43含量的增高，可促進神經元軸突的延伸〔5〕。GAP-43還可以作為細胞內信號傳導介質，增強其與G蛋白耦聯的受體轉運作用〔6〕。這就說明神經系統損傷之后的修復再生過程中，GAP-43扮演了重要角色〔7〕。本研究結果說明VD大鼠在經過丁苯酚注射液的治療后，其GAP-43在大鼠海馬組織內mRNA及蛋白表達均有所提高，從而促進VD大鼠損傷的神經元細胞再生修復，緩解其腦部缺氧狀態，改善不良癥狀。突觸素P38與GAP-43類似，對于神經元的損傷修復、生長發育也有一定的作用。它是一種鈣結合糖蛋白，其不僅可以促進神經元的損傷修復，還可以加快突觸之間的傳遞速度，從而進一步加快神經元的生長發育〔8〕。本研究結果表明，丁苯酚注射液可提高突觸素P38在大鼠海馬組織內mRNA和蛋白中的含量，從而促進神經元損傷修復，加快神經傳遞的速度，改善大鼠認知功能。

綜上所述，對于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治療，其可促進神經元的修復及再生，改善VD大鼠海馬區GAP-43及突觸素P38的表達，從而提供其認知功能，改善其預后。

4參考文獻

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〔2015-08-13修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號〕R741

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1830-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.017

基金項目：黑龍江衛生廳科研基金資助項目(項目編號：HD2014015)

1齊齊哈爾醫學院生物化學與分子生物學教研室

2哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院心內科

第一作者：陳慶友(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病的診斷及治療研究。