microRNA在成骨分化和骨代謝疾病中對Wnt信號通路調控作用的研究進展

陳 熙 郭健民 鄒 軍

(上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

microRNA在成骨分化和骨代謝疾病中對Wnt信號通路調控作用的研究進展

陳 熙1郭健民 鄒 軍2

(上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

microRNA；Wnt信號通路；成骨分化；骨代謝疾病

MicroRNA(miRNA，miRNAs)是一類長度在18-22nt的非編碼RNA，可以通過與靶基因的UTRs(3′-untranslated regions)結合使基因沉默或誘導mRNA降解、阻斷蛋白的翻譯來抑制靶基因的表達〔1〕。Wnt信號通路主要分為經典的Wnt/β-catenin信號通路和非經典的Wnt信號通路(鈣離子依賴的Wnt信號通路和Wnt細胞極性信號通路)。到目前為止有19個不同的Wnt蛋白(Wnt1，Wnt2，Wnt2B，Wnt3，Wnt4，Wnt5A，Wnt5B，Wnt6，Wnt7A，Wnt8A，Wnt8B，Wnt9A，Wnt9B，Wnt10A，Wnt10B，Wnt11，Wnt16)被發現，其在骨骼的發育和穩定中起著關鍵性作用〔2〕。最新研究發現microRNA可以調控Wnt信號通路關鍵因子的表達〔3〕。通過查閱相關文獻綜述其最新研究進展，為進一步研究提供理論基礎。

1 Wnt信號通路的信號傳導

經典的Wnt信號接收和傳遞需要Wnt蛋白與細胞表面受體蛋白Frizzled(Fzd)基因家族和輔助低密度脂蛋白受體蛋白(LRP)基因家族相結合〔4〕；使骨架蛋白(Dsh)激活來抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活化。非激活的GSK-3β不能使β-catenin磷酸化，從而使β-catenin免于被蛋白酶復合物降解，繼而進入細胞核內與轉錄因子(Tcf7和Lef1)相關聯實現對相關基因表達的調控〔5〕。經典的Wnt信號通路是成骨前體細胞分化、組織鈣化平衡、誘導潛能細胞和成骨前體細胞增殖、保持成骨細胞和骨細胞活性所必不可少的〔6〕。

鈣離子依賴的Wnt通路的信號傳導〔7〕：Wnt蛋白與受體Fzd相結合形成一個三蛋白復合物 Dsh-Axin-GSK，這個復合物可以調控輔助受體Ror1/2(tyrosine-protein kinase transmembrane receptor 1/2)的磷酸化。Wnt蛋白與受體Fzd、輔助受體Ror1/2的結合可以激活磷脂酶C(PLC)從而使三磷酸肌醇(IP3)、甘油三酯(DAG)和細胞內鈣離子的濃度升高，對下游的細胞功能進行調節〔8〕。細胞極性通路的信號傳導〔9〕：Wnt蛋白與Fzd以及一個輔助受體(Ror2或Ryk)相結合，從而使細胞骨架蛋白Rho相關蛋白激酶(ROCK)活化進而對c-Jun氨基末端液酶(JNK)進行調節，使其激活并對下游的轉錄因子進行調控。

2 microRNA通過調控Wnt信號通路在成骨分化中的作用

2.1 microRNA促進成骨分化

2.1.1 直接調控 Su等〔10〕通過生物學信息和功能測定發現miR-26a通過靶基因GSK3β實現對Wnt信號通路的調控；miR-26a的過表達可以增加骨髓間充質干細胞β-catenin表達，反之降低其表達。這表明miR-26a可以通過增加Wnt信號通路的表達促進骨髓間充質干細胞向成骨分化。Wang等〔11〕研究發現GSK-3β是miR-346的靶基因，誘導人的骨髓間充質干細胞向成骨分化后miR-346的表達增加，miR-346可以通過抑制GSK-3β的表達來激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進人的骨髓間充質干細胞向成骨分化。

2.1.2 間接調控 Li等〔12〕研究發現GSK3β和DKK1都是miR-29a的直接靶標，腫瘤壞死因子(TNF)-α可以通過抑制β-catenin的表達來抑制成骨細胞分化，miR-29a的過表達可以減弱TNF-α對成骨分化的抑制作用；這表明miR-29可以通過對其靶標GSK3β和人Oickkop相關蛋白1(DKK1)的抑制作用來激活Wnt信號通路，從而促進成骨分化。在經典的Wnt信號通路中，Wnt配體通過與蛋白受體(Frizzled 、LRP5/6)相結合來激活Wnt信號通路〔13〕，分泌型細胞外糖蛋白(sFRPs)包含一個與Frizzled 蛋白結構相似的區域，可直接與Wnt配體相結合，從而作為Wnt信號通路的內源性拮抗劑抑制Wnt信號通路〔14〕。Guo等〔15〕研究發現sFRPs是miR-27a的靶標，在人Sv40轉染成骨細胞(hFOB1.19)中miR-27a可以通過抑制sFRPs的表達，來激活Wnt信號通路，從而促進成骨細胞的增殖和分化。Zhang等〔16〕研究發現SFRP2和DKK2都是miR-218的靶基因，miR-218表達增加會顯著降低其靶基因SFRP2和DKK2的表達；在人脂肪來源干細胞中添加miR-218模擬物可以增加成骨標志物的表達、堿性磷酸酶(ALP)活性，同時使Wnt的表達增加。這表明miR-218可以通過抑制SFRP2和DKK2的表達，來激活Wnt信號通路，促進人脂肪干細胞向成骨分化。Zhang等〔17〕研究發現在小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)中，miR-335-5p可以通過抑制其靶基因DKK1的表達，來激活經典的Wnt信號通路從而促進成骨分化。Sost編碼的硬化蛋白可以干擾Wnt配體與Lrp5/6受體的結合，是Wnt信號通路的拮抗劑〔18〕。Chen等〔19〕研究發現Sost是miR-204的靶基因，miR-204的表達增加可以抑制Sost的水平。這表明miR-204可以通過抑制Sost的表達來激活Wnt信號通路，促進成骨分化。MiR-142-3p的過表達可以促進Hfob1.19細胞的分化，miR-142-3p可以通過抑制靶基因腺瘤性結腸息肉病(APC)的表達來促進β-catenin的表達，從而促進成骨分化〔20〕。

MicroRNA可以通過直接調控GSK3β使Wnt信號通路激活，從而促進成骨分化；同時也可以通過抑制Wnt信號通路的抑制劑的表達，間接地增加Wnt的表達促進成骨分化。

2.2 microRNA抑制成骨分化 Wu等〔21〕研究發現在骨髓間充質干細胞中添加miR-128模擬物會降低神經元細胞標志物mRNA和蛋白的表達水平，miR-128可以降低Wnt3a的表達，進一步通過生物學信息分析證明Wnt3a是miR-128的一個靶基因。這表明在骨髓間充干細胞中miR-128可以通過對其靶基因Wnt3a的調控，從而對骨髓間充質干細胞向神經元細胞的分化進行調控。Shi等〔22〕用地塞米松干預成骨細胞后發現miR-199a-5p的表達顯著增加，通過沉默或過表達miR-199a-5p發現，miR-199a-5p可以顯著增強地塞米松抑制成骨細胞增殖的作用；miR-199a-5p可以通過與WNT2的3′-UTR相結合從而抑制其表達，這表明miR-199a-5p可以通過調控Wnt信號通路在成骨細胞增殖中發揮關鍵性的作用。

Li等〔23〕通過細胞轉染發現添加miR-10a模擬物可以下調MC3T3-E1細胞β-cateninmRNA和蛋白的表達，miR-10a過表達會抑制MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化，其主要是通過調控β-catenin的表達實現。在人骨髓間充質干細胞中miR-141和miR-22的表達增加會抑制ALP活性，下調成骨標志物的表達同時減緩鈣化結節的形成；進一步通過生物學信息分析發現β-catenin是miR-141和miR-22的靶基因，這表明miR-141和miR-22可通過抑制β-catenin的表達來抑制成骨分化〔24〕。Wang等〔25〕研究發現LRP6(low-density lipoprotein receptor-related protein 6)是miR-30e的直接靶標，miR-30e表達增強會降低LRP6和β-catenin蛋白的表達；在小鼠的骨髓基質細胞中miR-30e通過抑制LRP6的表達，促進其成脂分化抑制成骨分化。這表明miR-30e可以作為骨質疏松治療潛在的靶標。T細胞因子3(TCF3)是經典的Wnt信號通路的一個轉錄因子，無論是在體內還是在體外TCF3均可促進成骨分化；Liu等〔26〕使用靶基因預測軟件篩選發現，Wnt信號通路的三個關鍵轉錄因子TCF3、TCF4、LEF1是miR-17潛在的靶基因，并進一步通過熒光素酶靶基因報告發現TCF3是miR-17的靶基因，在人的牙周膜干細胞中miR-17可以通過抑制TCF3的表達來抑制Wnt信號通路，從而抑制成骨分化。

miRNA可以通過直接調控Wnt蛋白的表達、Wnt信號通路的受體、轉錄因子以及其關鍵因子β-catenin的表達來抑制Wnt信號通路的激活，從而抑制成骨分化。

3 Wnt相關的骨代謝疾病中microRNA對Wnt的調控

2，3-已糖胺途徑(HBP1)是Wnt信號通路的內源性抑制劑。Sun等〔27〕研究發現HBP1是miR-155的靶標，miR-155可以抑制HBP1的表達；在骨肉瘤細胞中miR-155通過抑制HBP1的表達來激活Wnt信號通路，為骨肉瘤的臨床治療提供了潛在的選擇。神經管畸形相關蛋白(VANGL2)屬于非經典的Wnt信號通路，Althoff等研究發現與VANGL2是miR-542-3p的靶基因，miR-542-3p可以抑制U2O細胞VANGL2的表達；此外miR-542-3p通過抑制VANGL2的表達來抑制非經典的Wnt信號通路，從而在骨肉瘤的發病中起到致癌基因的作用〔28〕。Wei等〔29〕研究發現miR-217在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞系中的表達下調，在骨肉瘤細胞中Wnt5a促進細胞的增殖轉移，進一步研究發信Wnt5a是miR-217靶基因，在骨肉瘤中miR-217可以通過下調Wnt5a的表達來抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移。此外研究發現，與正常的成骨細胞相比骨肉瘤細胞系中miR-214的表達降低，Ror2表達增加；miR-214可以通過抑制其靶基因Ror2的表達來，來抑制非經典的Wnt的信號通路的激活〔30〕。

B細胞淋巴因子9(BCL9)是β-catenin蛋白轉錄的激活因子〔31〕，在多發性骨髓瘤(MM)中Wnt信號通路的激活可以促進MM細胞的增殖、存活、遷移和耐藥性同時可以促進MM腫瘤干細胞的形成〔32〕。Zhao等研究發現BCL9是miR-30c的靶標，在多發性骨肉瘤中miR-30s的表達降低，從而使BCL9的表達增加Wnt信號通路激活；此外在異體移植的小鼠MM模型中，miR-30c可以抑制MM細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導期凋亡〔33〕。這為探究MM的發病機制和治療提供了依據。

研究發現在骨肉瘤與MM中microRNA可以對Wnt信號通路的關鍵性轉錄因子進行調控，從而在兩者的發病中發揮關鍵性作用；同時也為骨肉瘤和MM的治療提供了潛在的靶基因。

綜上所述，Wnt信號通路是重要的骨代謝通路，在成骨分化以及骨代謝疾病中發揮關鍵性的作用。microRNA可以直接或間接的通過調控Wnt信號通路對成骨分化產生影響。同時microRNA也可以在骨肉瘤和多發性骨髓瘤中對Wnt信號進行調控，成為其潛在的致病基因或治療靶基因。這為明確骨代謝疾病如骨肉瘤、MM以及與成骨分化有關的骨質疏松的發病機制的研究以及臨床治療提供潛在的途徑。

1 Huntzinger E，Izaurralde E.Gene silencing by microRNAs：contributions of translational repression and mRNA decay〔J〕.Nat Rev Genet，2011；12(2)：99-110.

2 Lerner UH，Ohlsson C.The WNT system：background and its role in bone〔J〕.J Intern Med，2015；277(6)：630-49.

3 Mahmood S，Bhatti A，Syed NA，etal.The microRNA regulatory network：a far-reaching approach to the regulate the Wnt signaling pathway in number of diseases〔J〕.J Recep Sign Transduc Res，2016；36(3)：310-8.

4 Bejsovec A.Wnt signaling：an embarrassment of receptors〔J〕.Curr Biol，2000；10(24)：R919-22.

5 Eastman Q，Grosschedl R.Regulation of LEF-1/TCF transcription factors by Wnt and other signals〔J〕.Curr Opin Cell Biol，1999；11(2)：233-40.

6 Khosla S，Westendorf JJ，Oursler MJ.Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures〔J〕.J Clin Invest，2008；118(2)：421-8.

7 Kohn AD，Moon RT.Wnt and calcium signaling：beta-catenin-independent pathways〔J〕.Cell Calcium，2005；38(3-4)：439-46.

8 Kuhl M.The WNT/calcium pathway：biochemical mediators，tools and future requirements〔J〕.Front Biosci，2004；9：967-74.

9 Jenny A.Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye〔J〕.Curr Top Dev Biol，2010；93：189-227.

10 Su X，Liao L，Shuai Y，etal.MiR-26a functions oppositely in osteogenic differentiation of BMSCs and ADSCs depending on distinct activation and roles of Wnt and BMP signaling pathway〔J〕.Cell Death Dis，2015；6：e1851.

11 Wang Q，Cai J，Cai XH，etal.miR-346 regulates osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by targeting the Wnt/beta-catenin pathway〔J〕.PLoS One，2013；8(9)：e72266.

12 Li C，Zhang P，Gu J.miR-29a modulates tumor necrosis factor-alpha-induced osteogenic inhibition by targeting Wnt antagonists〔J〕.Dev Growth Diff，2015；57(3)：264-73.

13 Liu G，Vijayakumar S，Grumolato L，etal.Canonical Wnts function as potent regulators of osteogenesis by human mesenchymal stem cells〔J〕.J Cell Biol，2009；185(1)：67-75.

14 Suzuki H，Watkins DN，Jair KW，etal.Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer〔J〕.Nat Genet，2004；36(4)：417-22.

15 Guo D，Li Q，Lv Q，etal.MiR-27a targets sFRP1 in hFOB cells to regulate proliferation，apoptosis and differentiation〔J〕.PLoS One，2014；9(3)：e91354.

16 Zhang WB，Zhong WJ，Wang L.A signal-amplification circuit between miR-218 and Wnt/beta-catenin signal promotes human adipose tissue-derived stem cells osteogenic differentiation〔J〕.Bone，2014；58：59-66.

17 Zhang J，Tu Q，Bonewald LF，etal.Effects of miR-335-5p in modulating osteogenic differentiation by specifically downregulating Wnt antagonist DKK1〔J〕.J Bone Miner Res，2011；26(8)：1953-63.

18 Semenov M，Tamai K，He X.SOST is a ligand for LRP5/LRP6 and a Wnt signaling inhibitor〔J〕.J Biol Chem，2005；280(29)：26770-5.

19 Chen Q，Liu W，Sinha KM，etal.Identification and characterization of microRNAs controlled by the osteoblast-specific transcription factor osterix〔J〕.PLoS One，2013；8(3)：e58104.

20 Qi X，Li J，Zhou C，etal.MiR-142-3p suppresses SOCS6 expression and promotes cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；36(5)：1743-52.

21 Wu R，Tang Y，Zang W，etal.MicroRNA-128 regulates the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells by Wnt signaling〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；387(1-2)：151-8.

22 Shi C，Huang P，Kang H，etal.Glucocorticoid inhibits cell proliferation in differentiating osteoblasts by microRNA-199a targeting of WNT signaling〔J〕.J Mol Endocrinol，2015；54(3)：325-37.

23 Li J，Zhang Y，Zhao Q，etal.MicroRNA-10a influences osteoblast differentiation and angiogenesis by regulating beta-catenin expression〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；37(6)：2194-208.

24 Liang WC，Fu WM，Wang YB，etal.H19 activates Wnt signaling and promotes osteoblast differentiation by functioning as a competing endogenous RNA〔J〕.Sci Rep，2016；6：20121.

25 Wang J，Guan X，Guo F，etal.miR-30e reciprocally regulates the differentiation of adipocytes and osteoblasts by directly targeting low-density lipoprotein receptor-related protein 6〔J〕.Cell Death Dis，2013；4：e845.

26 Liu W，Liu Y，Guo T，etal.TCF3，a novel positive regulator of osteogenesis，plays a crucial role in miR-17 modulating the diverse effect of canonical Wnt signaling in different microenvironments〔J〕.Cell Death Dis，2013；4：e539.

27 Sun X，Geng X，Zhang J，etal.miR-155 promotes the growth of osteosarcoma in a HBP1-dependent mechanism〔J〕.Mol Cell Biochem，2015；403(1-2)：139-47.

28 Althoff K，Lindner S，Odersky A，etal.miR-542-3p exerts tumor suppressive functions in neuroblastoma by downregulating Survivin〔J〕.Int J Cancer，2015；136(6)：1308-20.

29 Wei R，Deng Z，Su J.miR-217 targeting Wnt5a in osteosarcoma functions as a potential tumor suppressor〔J〕.Biomed Pharmacother，2015；72:158-64.

30 Zhang C，Hu Y，Wan J，etal.MicroRNA-124 suppresses the migration and invasion of osteosarcoma cells via targeting ROR2-mediated non-canonical Wnt signaling〔J〕.Oncol Rep，2015；34(4)：2195-201.

31 Kramps T，Peter O，Brunner E，etal.Wnt/wingless signaling requires BCL9/legless-mediated recruitment of pygopus to the nuclear beta-catenin-TCF complex〔J〕.Cell，2002；109(1)：47-60.

32 Derksen PW，Tjin E，Meijer HP，etal.Illegitimate WNT signaling promotes proliferation of multiple myeloma cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2004；101(16)：6122-7.

33 Zhao JJ，Lin J，Zhu D，etal.miR-30-5p functions as a tumor suppressor and novel therapeutic tool by targeting the oncogenic Wnt/beta-catenin/BCL9 pathway〔J〕.Cancer Res，2014；74(6)：1801-13.

〔2015-09-29修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金項目(81572242)；上海市人類運動能力開發與保障重點實驗項目(上海體育學院)(No.11DZ2261100)；上海體育學院研究生教育創新計劃(yjscxz2015007)

鄒 軍(1969-)，男，教授，博士生導師，主要從事運動與防治骨質疏松研究。

陳 熙(1982-)，男，講師，博士，主要從事運動與防治骨質疏松研究。

R681

A

1005-9202(2016)24-6293-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.120

1 溫州醫科大學體育科學學院 2 上海體育學院發展規劃處