煙草N基因及其介導的抗TMV信號轉導分子機制

王　倩，劉貫山

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

煙草N基因及其介導的抗TMV信號轉導分子機制

王倩，劉貫山*

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

煙草N基因來源于粘煙草（Nicotiana glutinosa），通過特異識別煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的解旋酶結構引發植物的過敏性壞死反應，介導植物對該病毒的抗性。N-TMV互作是研究最早且最深入的植物-病原菌互作的模型之一。從N基因的分離、轉錄表達、編碼產物結構及其抗TMV信號轉導分子機制等方面進行了綜述。

N基因；煙草；TMV；信號轉導

煙草N基因來源于煙草野生種粘煙草（Nicotiana glutinosa），是植物中鑒定的第一個TIR-NBS-LRR類（Toll-interleukin-1 receptor/nucleotide-binding site/leucine-rich repeat）抗病基因（resistance gene，R）[1]。N基因可特異識別煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）解旋酶結構域（p50），進而引起植物的過敏性壞死反應（hypersensitive reaction，HR），把病毒局限在壞死部位，從而抵抗TMV的復制增殖。TMV-含N基因煙草的相互作用是研究病原物-寄主植物互作的經典模型之一[2]。

1　煙草N基因

1.1N基因的克隆及其功能驗證

1914年Allard等[3]發現，粘煙草及普通煙草與粘煙草的雜交后代在接種TMV后未表現出花葉癥狀，相反，接種葉片均發生HR，TMV則存在于壞死斑及其周圍。Holmes[3]以普通煙草與粘煙草的漸滲雜交系為試驗材料，對該材料的抗TMV遺傳特性進行了較為系統的研究，并首次提出了“N”基因的概念，即“對TMV侵染的壞死型反應”（necrotic-typeresponsetoinfectionwith tobacco-mosaic virus）。研究認為，N基因是一個顯性單基因，在普通煙草中的隱性等位基因被稱為“n”。1994年，Whitham等[1]通過轉座子標簽法從抗TMV的普通煙草中克隆得到N基因，確定了N基因的序列、轉錄產物及編碼蛋白的結構特點，并證實了N基因介導了煙草對TMV的抗性。隨后，將N基因通過轉基因技術轉入番茄（Lycopersicon esculentum），再次確定N基因可導致轉基因番茄對TMV產生HR反應，病毒局限于枯斑部位[4]。類似的結果也在本生煙（N.benthamiana）上被證實[5]。目前，除了TMV Ob生理小種（ToMV-Ob），N基因可介導煙草對其他所有的TMV小種產生HR[6]。

1.2N基因介導的過敏性壞死反應

N基因介導的抗TMV反應有兩個特點：（1）TMV侵染含N基因煙草后約48 h就會產生HR，即煙草在侵染位點處形成壞死斑，病毒被限制在枯斑及其鄰近部位。HR大致可分為兩個階段：侵染早期，入侵的細胞或組織急劇地解體；在隨后一段相對較長的時間內，周圍剩余組織再緩慢死亡[7]；（2）N基因介導的TMV抗性要求特定的溫度范圍。只有在28℃以下，受TMV侵染的N基因煙草才表現HR反應，當溫度高于28℃時，TMV則在植株體內系統地傳播，而溫度重新降至28℃以下后，植株會發生系統性的HR，造成整株死亡[8]。N基因介導的“抗病溫敏性”反映了病毒和寄主之間溫敏性互作的特點。N基因煙草產生HR反應后，在隨后的一段時間內植株能夠獲得系統抗性（systemic acquired resistance，SAR），對后續TMV及其他類似病原的入侵產生抗性[2]。

1.3N基因對應的無毒因子

根據Flor的“基因對基因”假說，在寄主植物中存在一個抗病基因R，在病原菌中就存在一個相應的無毒基因（avirulence，Avr）；由病原菌無毒基因編碼的無毒因子作為激發子與其寄主植物的抗病基因產物相互作用，從而引發抗病反應[9]。TMV的基因組為一條單鏈正義RNA，全長6395 nt，編碼至少4個蛋白，包括126 kDa和183 kDa的復制酶、30 kDa的病毒運動蛋白和17.5 kDa的病毒外殼蛋白[6]。早期研究發現，TMV 126-kDa的復制酶能夠引起N基因介導的HR反應[6,10]。利用瞬時表達及轉基因技術等進一步證實，位于126 kDa復制酶羧基端末端的約50 kDa的解旋酶片段（p50）能夠導致N基因轉錄產物的積累，并有效地引起N基因介導的HR反應，且該HR反應也對溫度敏感。因此，編碼p50的核苷酸序列又被稱為N基因對應的無毒基因[11,12]。

2　煙草N基因的編碼產物及轉錄水平表達特性

2.1N基因編碼蛋白的結構特點

N基因全長6656 bp，含有5個外顯子和4個內含子，可轉錄出NS（3432 nt）和NL（1956 nt）2個轉錄本。NS編碼的全長N蛋白由1144個氨基酸組成，分子量為131.4 kDa。其氨基酸端具有與果蠅Toll蛋白及哺乳動物白細胞介素-1受體（Toll and interleukin-1 receptor，TIR）的胞質區相似的結構域，稱為TIR結構。N蛋白的中間區段含有形成核酸結合區（nucleotide-binding site，NBS）所需的P-loop、kinase 2和kinase 3a 3個結構域。216～223位的氨基酸序列為GMGGVGKT，符合P-loop的保守序列(A/G)XXXXGK(S/T)，在結合ATP/GTP的過程中起作用。N蛋白297～301位的氨基酸序列為LIVLD，符合Kinase 2a的結構特征，即4個連續疏水氨基酸緊挨1個天冬氨酸，在磷酸轉移反應中催化二價陽離子Mg2+或Ca2+的可逆的轉移。N蛋白320～325位的氨基酸序列為FGNGSR，符合Kinase 3a結構特征，該結構具有結合嘌呤或核糖的功能。N蛋白的羧基端為LRR（leucine-rich repeat）結構域，含有14個不完全的LRR重復。每個LRR約有26個氨基酸組成。由于LRR結構域多介導蛋白-蛋白或蛋白-細胞膜間的特異互作，推測N蛋白可能通過LRR結構所致的互作而行使功能[1,8]。

N基因內部第3個內含子中含有一個70 bp的交替外顯子（alternative exon，AE）。該元件使N基因在轉錄時發生選擇性剪切，形成另一個轉錄本NL。同時，選擇性剪切導致相位改變，NL翻譯形成一個截短的蛋白Ntr。Ntr蛋白由652個氨基酸組成，分子量為75.3 kDa，該蛋白含有TIR結構、NBS結構和1個LRR，移碼突變導致其羧基端36個氨基酸不同于完整的N蛋白[1,8]。

N蛋白的TIR、NBS和LRR結構域與其識別TMV配體的蛋白復合物有關，能夠激發信號轉導途徑誘導防御反應[1,8]。關鍵氨基酸基團的缺失和定點氨基酸突變表明，這3個結構域對N基因的功能都是不可缺少的[13]。

2.2N蛋白的定位及其寡聚化

植物某些R蛋白的亞細胞定位取決于其Avr。通過定位試驗或細胞組分分離檢測，N蛋白和p50在細胞核和細胞質中均有分布。在寄主植物其他蛋白因子的協助下，細胞質中的N蛋白識別p50，而細胞核內的N蛋白起始抗病反應。N基因的TMV抗性需要N蛋白的細胞核內定位，但與p50的細胞核內定位無關[14]。

TIR-NBS-LRR抗病蛋白家族與哺乳動物的NOD 蛋 白 （ nucleotide binding oligomerization domain proteins）家族、類Toll受體家族（Toll-like receptors，TLRs）和白細胞介素-1受體家族（interleukin-1 receptors，IL-1R）在結構上存在很大相似性。后三者均存在寡聚化（oligomerization）的特點。研究發現，N蛋白在p50存在的情況下可發生寡聚化[15]。對N基因突變體聚合能力和抗TMV功能進行檢測發現，N蛋白的p-loop環發生氨基酸突變，影響N的聚合，N蛋白喪失抗病毒功能；RNBS-A結構域和TIR結構域內的氨基酸突變可導致N蛋白的抗病功能削弱，但具有聚合的能力。因此，推測N蛋白的寡聚化位于N基因介導的抗病反應的上游[15]。

2.3煙草N基因的表達特性

NS和NL的表達受TMV侵染和溫度的誘導和調控。早期研究發現，健康和TMV侵染后前3 h的煙草中，N基因的轉錄產物以NS為主；TMV侵染后4～8 h內，轉錄產物則以NL為主，表明煙草在感受TMV入侵的信號后，通過調控N基因的可變剪切，分配NS和NL的比率和表達時間來抵抗病毒。N基因下游基因組調控序列（3?genomic regulatory sequences，3?GS）和第III內含子中包含的AE元件均能影響到可變剪切，它們在N基因介導的抗TMV過程中發揮十分關鍵的作用[16]。Levy等[17]采用實時熒光定量PCR試驗發現，接種TMV后，煙草接種葉和上位葉中N基因的轉錄水平明顯上調，分別增至接種前的38倍和165倍，而接種馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）后其轉錄水平無變化，表明TMV侵染可特異地誘導N基因轉錄水平的上調。更深入的研究發現，N基因轉錄水平上調需要同時具備兩個要素，即TMV的侵染復制和一定時段的低溫處理（20℃，2～6 h）。只有低溫處理達到一定閾值后，N基因轉錄產物積累到某種程度后，植物才會誘發產生HR。煙草對TMV的完全抗性需要NS和NL的協同參與，缺少任何一種都導致轉N基因煙草不具備對TMV的完全抗性[12]。

3　煙草N基因介導的抗TMV信號轉導分子機制

植物利用其自身的R基因抵御病原物入侵這一過程大致分為病原物的識別、信號轉導和防衛反應3個階段。煙草N基因介導的TMV抗性也不例外。目前，多個與N基因介導的抗TMV信號轉導相關的基因得到相繼鑒定與分離，一些信號轉導的模型或假設也在此基礎上逐漸形成。

3.1N蛋白與其無毒因子p50的互作

目前，N蛋白是否可直接結合其無毒因子p50還存在爭議。2006年Ueda等[18]的研究發現，（1）p50可直接結合N蛋白；（2）兩者互作需要ATP的參與，即ATP需先與N蛋白形成ATP/N蛋白復合體；（3）N蛋白具有ATP酶活性，而p50可以提高該活性。N蛋白在ATP存在的條件下，其自身可產生分子內或分子間的互作，而p50可干擾該互作過程。因此，推測N蛋白可與ATP形成復合體，p50與之互作后提高了N蛋白的ATP水解活性，導致ADP/N蛋白復合體構象改變，從而加速了其與下游信號因子的互作。Burch-Smith等[14]認為，N蛋白通過其TIR結構與p50在細胞質中發生間接地相互作用，p50與N不能直接結合，還需要植物中其他輔助因子的參與。

3.2參與N基因介導的抗TMV過程中的植物蛋白因子

盡管N蛋白與p50是否直接互作還存在不同觀點，但目前研究表明，絕大多數R蛋白是借助植物中的其他輔助因子間接識別其Avr蛋白的[14]。這種觀點與“防衛假說”（guard hypothesis）基本一致。防衛假說認為，在病原物建立侵染的過程中，Avr蛋白引起了寄主植物中某種蛋白的變化（該蛋白通常情況下可受Avr的招募）。植物R基因可通過監控植物自身蛋白或蛋白復合物的變化，間接地識別Avr或病原[9]。目前，從煙草中分離到的參與N介導的抗TMV反應的蛋白因子包括激酶、轉錄因子、熱擊蛋白和一些生物酶等。

3.2.1NRIP 1NRIP1（N receptor-interacting protein 1）是利用酵母雙雜交方法鑒定得到的一種與N蛋白的TIR結構域和p50均產生相互作用的硫氰酸酶（硫轉移酶）。沉默該基因后，N基因介導的TMV抗性受到一定程度的削弱。NRIP1通常定位于葉綠體，p50改變了它的定位，使之在細胞質和細胞核中也有分布。在p50存在的條件下NRIP1才與N結合。推測NRIP1在受到p50的招募后，部分蛋白的定位發生改變，與p50形成蛋白復合體，而后該復合體被N蛋白識別，激活了抗病的信號傳導過程[19]。

3.2.2SPL6SPL6（squamosa promoter binding

protein-like 6）是一個含有保守的SBP（squamosa promoter binding protein）結構域的轉錄因子。研究發現，在Avr基因p50存在的條件下，SPL1與N蛋白在核小體內互作。N蛋白NBS結構域中的P-loop區是ATP結合位點，該區段對N的抗TMV能力和維持N-NbSPL6的互作十分關鍵，但該區域的突變不影響N-p50的結合，因此推測N蛋白與ATP的結合對N-NbSPL6十分重要。利用病毒介導的基因沉默技術（virus-induced gene silencing，VIGS）試驗表明N基因介導的TMV抗性需要SPL6的參與，沉默該基因后植株對TMV的抗性減弱[20]。核定位的RPS4介導的抗病過程需要SPL6的參與，而細胞膜定位的RPM1和RPS2介導的抗病過程則不需要SPL6的參入。因此推測，SPL6正向調控了兩種不同的TIR-NBS-LRR類R基因抗性的信號轉導過程[20]。

3.2.3Rar1、EDS1和NRP1/NIM1Rar1、EDS1 和NRP1/NIM1是已被鑒定的參與R或水楊酸介導的抗病反應的基因。Rar1是含有兩個串聯的CHORD（cysteine-and histidine-rich domains）鋅指結構的鋅離子結合蛋白，最早從大麥中獲得，參與大麥多個R基因介導的白粉病抗性和調控侵染細胞內過氧化氫的積累[21]。EDS1（enhanced disease susceptibility 1）是擬南芥中報道的一個類脂肪水解酶基因，該基因參與多個TIR-NBS-LRR類基因（RPS4、SNC1和RPS6等）介導的抗卵菌過程[22]，其缺失突變體的抗病性明顯降低。NPR1/NIM1 （nonexpressor of PR genes 1/noninducible immunity 1）是一個轉錄因子調節蛋白，該蛋白正向調控抗病基因的表達，參與水楊酸介導的系統獲得性抗性SAR[23]。為確定Rar1、EDS1和NRP1/NIM1在N介導的抗TMV信號轉導過程中的作用，利用VIGS分別沉默含N基因本生煙中的NbRar1、NbEDS1 和NbNRP1。結果發現，煙草的抗TMV能力均受到不同程度的削弱，表明三者均參與N介導的抗TMV信號傳導路徑[5]。

3.2.4SGT1、Hsp90和COP9蛋白互作方面的研究發現，Rar1可直接結合SGT1和Hsp90。SGT1 （suppressor of G2 allele of Skp1）是細胞中一種特殊的SCF連接酶E3復合體的組分。以本生煙為試驗材料發現，NbRar1、NbSGT1同時與參與泛素-蛋白酶體介導的蛋白降解過程的COP9信號轉導體（COP9 signalosome，CSN）在體內產生互作，形成NbRar1-NbSGT1-COP9復合體。VIGS試驗表明，沉默NbSKP1、NbSGT1、COP9信號轉導體的亞基NbCSN3和NbCSN8，N基因介導的TMV抗性減弱，表明三者均參與了該信號轉導過程，同時也意味著該抗病過程涉及蛋白的泛素化[24]。

Hsp90是真核生物細胞中普遍存在且高度保守的依賴ATP的分子伴侶，它參與細胞內多種生物學過程，具有重要的生理功能。當NbRar1與Hsp90互作時，由于Hsp90可直接結合N蛋白，因此形成N-Hsp90-NbRar1-NbSGT1復合體。VIGS試驗也證實沉默Hsp90導致N基因介導的TMV抗性減弱，表明Hsp90參與了信號轉導[24,25]。

3.2.5MAPK級聯系統N基因介導的抗TMV信號轉導過程涉及蛋白可逆磷酸化。利用蛋白酶抑制劑進行藥理學研究表明，一些激酶和磷酸酶參與對TMV的防御反應[26]。TMV侵染含N基因煙草后導致兩種分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活，分別是48 kDa的水楊酸誘導蛋白激酶（salicylic acid-induced protein kinase，SIPK）和 44 kDa的傷誘導蛋白激酶（wound-induced protein kinase，WIPK）。其中，TMV對WIPK的激活依賴于N蛋白，而不依賴于水楊酸。TMV侵染所造成的WIPK在轉錄水平的上調和蛋白水平的激活通常是系統性的。WIPK也是SIPK的激活對象[27]。NtMEK2是位于兩激酶上游的MAPK，它能激活后兩者的活性。表達SIPK/WIPK 或 單 獨 表 達 組 成 型 NtMEK2 （NtMEK2DD）均可引起類似HR的細胞死亡。采用VIGS技術抑制這3個MAPK的表達，均能有效地削弱N基因介導的TMV抗性[28,29]。SIPK和WIPK的活化可進一步激活某些WRKY轉錄因子活性，從而導致含有W-box順式元件抗病基因的上調。推測NtMEK2-SIPK/WIPK級聯反應可能通過激活一些WRKY轉錄因子調控下游抗病基因表達，在N基因介導的抗性過程中發揮正向調控作用[30]。

Hsp90、MAPK級聯反應和線粒體失活均與TMV引起的HR反應有關。研究發現，在植物中沉默Hsp90或抑制Hsp90的活性，只削弱了由p50誘發的HR，而對NtMEK2或Bax過表達導致HR無影響。抑制Hsp90也降低了NtMEK2、WIPK和SIPK的活力。缺失WIPK和SIPK，削弱了p50和NtMEK2誘發的HR反應。這表明Hsp90位于MAPK級聯系統的上游。因此，在N基因介導的抗病過程中，抗病信號按照Hsp90-MAPKs-線粒體失活的順序向下游傳遞最終引起了細胞死亡[31]。

3.2.6NbCRT2、NbCRT3、NbERp57和NbP52009 年Caplan等[32]利用雙向電泳和iTRAQ技術，分析了TMV侵染前后煙草中的表達差異蛋白，發現病毒侵染后的上調蛋白多是細胞質分子伴侶和內質網分子伴侶。沉默內質網的硫鍵異構酶基因NbERp57、NbP5和鈣網蛋白基因 NbCRT2和NbCRT3均導致抗TMV能力的部分喪失。NbCRT2 和NbCRT3在一個類誘導受體激酶IRK表達中發揮作用，后者則是一個定位于細胞膜的激酶，在N介導的超敏反應、細胞程序性死亡和TMV抗性所需。這些數據表明定位于內質網的分子伴侶也參與N介導的TMV抗病反應[32]。

3.2.7WRK類傷誘導受體蛋白激酶（wound-induced receptor-like protein kinase，WRK）是煙草中分離得到的一個在依賴N基因的過敏性細胞死亡過程的早期階段上調表達的基因，該基因編碼一個富LRR結構的類受體激酶，具有谷胱苷肽S-轉移酶活性。該基因的表達受損傷的誘導，具有溫敏特性[33]。沉默WRK導致SIPK和WIPK的活力下降。推測WRK在SIPK和WIPK的上游發揮作用，參與損傷信號轉導過程，該基因在N介導的TMV抗性過程中的作用還需進一步研究[34]。

3.3N基因介導的信號轉導模型

2013年Dinesh-Kumar課題組[20]綜合多年的研究結果，提出了N基因介導的TMV識別過程及下游抗病基因誘導過程。在TMV未侵染的細胞中，N蛋白（或借助寄主蛋白）處于活性被抑制的狀態，分布在細胞核和細胞質中。NRIP1定位于葉綠體中，核內的N蛋白并未與SPL6結合。當TMV通過機械損傷進入植物體內后，病毒在細胞質中脫殼，進行復制、轉錄和翻譯。病毒126 kDa的復制酶或p50激發子引起了NRIP1的重新定位，NRIP1與p126 或p50結合后，被細胞質中的N蛋白識別，三者形成NRIP1-p50-N復合體。隨著三者的結合，p50引起了N蛋白構象上的變化（該變化可能需要ATP結合或水解）。結合ATP的N蛋白進入細胞核，與SPL6互作從而激活了下游抗性基因的表達。另一種可能是，在NRIP1-p50-N復合體形成后，N蛋白利用LRR區域與p50形成次級結合，釋放出TIR-NBS區段以提高核酸結合能力，促成N蛋白的聚合。該聚合過程不排除其他寄主蛋白的協助。聚合且處于激活狀態的N蛋白進入核內，與SPL6結合，引起下游基因的表達。

另外一種N基因介導的信號轉導過程涉及Hsp90和MAPK級聯反應。TMV p50激活N基因的表達后，N通過某種機制將信號傳遞給Hsp90，Hsp90進而通過MAPK級聯反應放大信號，導致線粒體的機能失調，進而引起細胞死亡[31]。或通過該途徑激活某些參與抗病過程的WRKY轉錄因子的表達，由WRKY誘導或上調抗病基因的表達水平，引起植物的抗病反應[30]。

4　問題與展望

近年來，N基因介導的TMV信號轉導的分子機制研究取得了很大進展，一些參與該過程的基因被分離并得以鑒定。但由于該過程涉及多個通路、多個細胞器和眾多蛋白復合體的參與，還有很多問題懸而未決，闡明其抗病機理尚需大量深入細致的研究。TMV寄主廣泛，能夠侵染200多種植物，不僅嚴重危害煙草的農業生產，也是其他蔬菜類作物，尤其是茄科、葫蘆科等經濟作物的重要病原，造成的經濟損失十分重大。在目前已發現的抗TMV基因中，N基因介導的抗性最廣泛且最有效。如何高效利用N基因是研究人員亟待解決的問題。

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[33]Ito N,Takabatake R,Seo S,et al.Induced expression of a temperature-sensitiveleucine-richrepeatreceptor-like protein kinase gene by hypersensitive cell death and wounding in tobacco plant carrying the N resistance gene[J].Plant Cell Physiol,2002,43(3):266-274.

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The Tobacco N Gene and the Signal Transduction of N-mediated TMV Resistance

WANG Qian,LIU Guanshan*
(Tobacco Research Institute,ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao 266101,China)

Tobacco N gene,cloned from wild tobacco Nicotiana glutinosa,confers resistance to tobacco mosaic virus(TMV)by recognizing the helicase domain of 126 kDa TMV replicase and triggering the hypersensitive reaction at the infection site in plants. The N-TMV interaction is one of the earliest and most studied models of plant-pathogen interaction.Here,we review the isolation, expression,protein structure-function analysis of N gene and the current understanding of the N-mediated signal transduction and other aspects.

N gene;tobacco;TMV;signal transduction

S572.03

1007-5119（2016）03-0093-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.016

中國煙草總公司基因組重大專項項目[110201301005（JY-05）]

王倩（1984-），副研究員，主要從事煙草突變體研究。E-mail：wangqian01@caas.cn。*通信作者，Email:liuguanshan@caas.cn

2016-05-15

2016-06-23