α7神經(jīng)型尼古丁受體基因抑制對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Tau和配對(duì)螺旋樣纖維蛋白1水平的影響

周 飛 張淑麗 李 毅 王 凡 官志忠 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

·基礎(chǔ)研究·

α7神經(jīng)型尼古丁受體基因抑制對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Tau和配對(duì)螺旋樣纖維蛋白1水平的影響

周 飛 張淑麗 李 毅 王 凡1官志忠 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的探討α7神經(jīng)型尼古丁受體 (nAChR) 基因沉默對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Tau和配對(duì)螺旋樣纖維蛋白(PHF)1水平的影響及α7 nAChR在阿爾茨海默病 (AD) 發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA重組質(zhì)粒，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡法分別測(cè)定細(xì)胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；用Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞Tau和PHF1蛋白水平。結(jié)果 α7 nAChR基因沉默組與空質(zhì)粒組相比，α7 nAChR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平分別降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)；Tau蛋白水平升高了65% (P<0.01)；PHF1蛋白水平升高了58% (P<0.05)。結(jié)論 α7 nAChR基因表達(dá)抑制后Tau和PHF1蛋白水平明顯升高，Tau蛋白和PHF1蛋白表達(dá)增加直接促進(jìn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成，這可能與AD的病理進(jìn)程有一定關(guān)系。

阿爾茨海默病；Tau；配對(duì)螺旋樣纖維蛋白1；α7神經(jīng)型尼古丁受體

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)元退行性變疾病，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退等〔1〕。病理學(xué)以細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)過(guò)度沉積形成的老年斑(SPs)以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)為主要特征〔2〕。高度磷酸化后的tau蛋白與微管分離，加速微管解聚，可自身聚集促進(jìn)配對(duì)螺旋樣纖維(PHF)的形成〔3〕。PHF是NFT的主要成分，也是AD病理變化的基本元素〔4〕，PHF表達(dá)水平與Tau蛋白及Tau蛋白磷酸化程度密切相關(guān)，Tau蛋白過(guò)度磷酸化使游離Tau增多，游離Tau蛋白是形成PHF的前提基礎(chǔ)，二者共同加速NFT的形成。在AD患者大腦的海馬、皮質(zhì)區(qū)，尼古丁受體數(shù)目減少，α7 亞單位蛋白表達(dá)明顯降低，α7神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)與神經(jīng)細(xì)胞毒性作用緊密相連〔5〕，在AD相關(guān)病變研究中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)用體外合成的α7 nAChR shRNA Plasmid(h)轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，研究受體抑制后Tau蛋白和PHF1蛋白表達(dá)情況，探究α7 nAChR與Tau和PHF1蛋白之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞由本課題組保存；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA 表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞由本課題組液氮保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于Hyclone公司；嘌呤霉素購(gòu)于Sigma公司；Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；α7 nAChR、β-actin引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo公司；兔抗人Tau單克隆抗體(ab32057)、兔抗人PHF1單克隆抗體(ab184951)均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；鼠抗人β-actin 單克隆抗體(M20010)購(gòu)于美國(guó)Abmart公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(7074s)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(ZB2305)購(gòu)于中杉金橋公司，蛋白marker購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；5×蛋白上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)-Plus發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Millipoe公司；膠片購(gòu)于中國(guó)柯達(dá)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 空白組SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM為培養(yǎng)基，其中添加10%胎牛血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA Plasmid (h)實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染Control shRNA Plasmid-B空載體組SH-SY5Y細(xì)胞以添加13%胎牛血清、0.004 g/L嘌呤霉素的DMEM為培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)α7 nAChR mRNA表達(dá)水平 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。α7 nAChR和內(nèi)參β-actin引物序列見(jiàn)表1，用ABI StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采集α7 nAChR及內(nèi)參β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，用SDS2.1軟件收集熒光信息并分析相關(guān)資料，主要分析α7 nAChR ΔΔCt值及RQ值，RQ=2-ΔΔCt。計(jì)算沉默組與空載體對(duì)照組之間的相對(duì)水平。

1.4 Western印跡檢測(cè)α7 nAChR、Tau及PHF 1蛋白表達(dá)水平 按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制裂解液，收集細(xì)胞，用冷凍離心機(jī)12 000 r/min、4℃、15 min離心，吸取蛋白質(zhì)上清液。采用二甲基哇啉(BCA)定量法測(cè)定蛋白濃度；運(yùn)用Western印跡法檢測(cè)α7 nAChR、Tau和PHF1蛋白表達(dá)水平及其各自?xún)?nèi)參β-actin的蛋白表達(dá)情況。運(yùn)用Image J 軟件進(jìn)行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算α7 nAChR、Tau、PHF1蛋白條帶相對(duì)其內(nèi)參的灰度比值并作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組蛋白復(fù)孔二個(gè)，進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

基因引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)α7nAChR5′accactcaccgtctacttctcc3′1675′tgatgtcgccgatgatgc3′β?actin5′tggcaccacaccttctacaatg3′1035′tcatcttctcgcggttggc3′

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細(xì)胞α7nAChR mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平 受體沉默組與空質(zhì)粒組相比，α7nAChR mRNA〔(0.06±0.02)vs(1.05±0.06)〕和蛋白質(zhì)水平〔(18±6) vs (104±5)〕分別降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)。說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α7 nAChR shRNA 表達(dá)質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞，α7 nAChR 在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)受到明顯抑制。

2.2 α7 nAChR基因沉默對(duì)Tau和PHF1蛋白表達(dá)水平的影響 受體沉默組與空質(zhì)粒組相比，Tau蛋白〔(171±8)vs(104±14)〕和PHF1蛋白質(zhì)〔(162±7)vs(102±9)〕水平分別升高了65%(P<0.01)和58%(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 α7 nAChR基因沉默細(xì)胞Tau和PHF1蛋白表達(dá)水平

3 討 論

在AD的發(fā)展過(guò)程中，nAChR 扮演重要角色，通過(guò)對(duì)AD患者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)大腦皮層萎縮、nAChRs密度降低、數(shù)量減少〔6〕。給予α7nAChR特異性激動(dòng)劑處理后，能減弱Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用〔7〕。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元尼古丁能降低Aβ 聚集及其引起的神經(jīng)毒性〔8〕；同時(shí)，用α7 nAChRs激動(dòng)劑處理細(xì)胞，Tau蛋白磷酸化水平增高，而預(yù)先用α7 nAChRs阻滯劑處理后，Aβ誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化水平減弱〔9〕。采用RNA 干擾技術(shù)，沉默SH-SY5Y 細(xì)胞α7 nAChR，Aβ毒性作用可以明顯增強(qiáng)〔10〕，尼古丁受體對(duì)Aβ造成的毒性損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。另外，也有研究認(rèn)為AD患者中α7 nAChR明顯減少，是由于其與Aβ相互作用所致并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，因此猜測(cè)α7 nAChR激動(dòng)劑可能會(huì)成為治療AD很好的藥物〔11〕。

近年來(lái)研究較多的AD主要病變特點(diǎn)之一NFT由Tau蛋白誘導(dǎo)形成，Tau蛋白是一種神經(jīng)元微管相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白，主要在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，生物學(xué)功能以催化微管裝配和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)為主。在AD患者腦內(nèi)Tau蛋白主要存在三種形式，即細(xì)胞質(zhì)正常Tau蛋白(C-Tau)，過(guò)度磷酸化易溶型Tau蛋白(ADP-Tau)和聚集成配對(duì)PHF的Tau蛋白(PHF-Tau)；在PHF-Tau中已發(fā)現(xiàn)45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要是絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)殘基的磷酸化。Tau高度磷酸化后穩(wěn)定性降低，不僅可以加速微管解體，自身聚集成PHF〔3〕，還能加快游離Tau蛋白在大腦和腦脊液中沉積形成細(xì)胞內(nèi)NFT〔12〕。NFT通過(guò)損傷神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和tau蛋白功能等多種途徑導(dǎo)致強(qiáng)大的神經(jīng)毒性。

Tau蛋白作為AD一種主要研究蛋白，在其他疾病中也逐漸被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)證實(shí)有超過(guò)20種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病與Tau蛋白有關(guān)〔13〕。在與Tau相關(guān)的疾病中，幾乎都主要表現(xiàn)為T(mén)au蛋白的磷酸化異常從而大量聚集形成NFT〔14〕。病理學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AD患者出現(xiàn)癡呆的嚴(yán)重程度與其腦組織中的NFTs數(shù)量呈正相關(guān)〔15〕。在病理狀態(tài)下，Tau蛋白往往被異常磷酸化，高度磷酸化的Tau蛋白失去與微管的結(jié)合能力，微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致神經(jīng)元骨架瓦解，引起AD發(fā)病，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離Tau蛋白增多，游離的異常磷酸化Tau蛋白彼此連接形成PHF，成對(duì)螺旋絲再相互纏繞成混合微絲，最后高度聚集形成NFT。也就是說(shuō)，異常過(guò)度磷酸化Tau蛋白是PHF亞單位，PHF又作為NFT的主要組成成分逐步促成AD的病理發(fā)展。螺旋絲種類(lèi)繁多，PHF1即為PHF中較為常見(jiàn)的一種，雖然目前PHF在AD的相關(guān)研究中提及不多，但其作為NFT形成的關(guān)鍵及主要元素，其對(duì)AD的發(fā)病研究有著更深刻的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α7 nAChR基因表達(dá)沉默時(shí)，Tau蛋白和PHF1蛋白水平都明顯升高，說(shuō)明α7 nAChR可以調(diào)節(jié)Tau和PHF蛋白的表達(dá)，從而影響NFT的形成過(guò)程，在AD的發(fā)病中起著重要作用。

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〔2016-05-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on level of Tau and PHF1 protein in SH-SY5Y cells

ZHOU Fei,ZHANG Shu-Li,LI Yi,et al.

The Key Laboratory of Molecular Biology Laborary, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China

Objective To investigate the influence of inhibited gene expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on the level of Tau and PHF1 proteins in SH-SY5Y cells and study the role of α7 nAChR in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD).Methods The level of α7nAChR mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of Tau and PHF1 were determined by Western blot.Results Compared with negative controls, the expression of α7nAChR at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells with α7 nAChR silencing were decreased by 94% and 82%, respectively. And the expression of Tau and PHF1 proteins were increased by 65% and 58%, respectively.Conclusions The inhibited gene expression of α7 nAChR by RNA interference may markedly stimulate the expression of Tau and PHF1 proteins, which directly might develop the formation of NFT, so the variation of Tau and PHF1 proteins induced by α7 nAChR gene silencing may be related to the pathogenesis of AD.

Alzheimer's disease;Tau;PHF1;α7 nAChR

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360178)；教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(IRT13058)；貴州省科技廳重大專(zhuān)項(xiàng)(黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項(xiàng)目(201344，黔科合J字〔2012〕2055)

齊曉嵐(1976-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆發(fā)病機(jī)制研究。

周 飛(1990-)，女，碩士，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

R749.01

A

1005-9202(2016)24-6049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.001

1 貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科