α7神經型尼古丁受體基因抑制對SH-SY5Y細胞Tau和配對螺旋樣纖維蛋白1水平的影響

周 飛 張淑麗 李 毅 王 凡 官志忠 齊曉嵐

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

·基礎研究·

α7神經型尼古丁受體基因抑制對SH-SY5Y細胞Tau和配對螺旋樣纖維蛋白1水平的影響

周 飛 張淑麗 李 毅 王 凡1官志忠 齊曉嵐

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的探討α7神經型尼古丁受體 (nAChR) 基因沉默對SH-SY5Y細胞Tau和配對螺旋樣纖維蛋白(PHF)1水平的影響及α7 nAChR在阿爾茨海默病 (AD) 發病機制中的作用。方法 SH-SY5Y細胞轉染α7 nAChR shRNA重組質粒，用實時熒光定量PCR和Western印跡法分別測定細胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表達水平的變化；用Western印跡法檢測細胞Tau和PHF1蛋白水平。結果 α7 nAChR基因沉默組與空質粒組相比，α7 nAChR mRNA和蛋白質表達水平分別降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)；Tau蛋白水平升高了65% (P<0.01)；PHF1蛋白水平升高了58% (P<0.05)。結論 α7 nAChR基因表達抑制后Tau和PHF1蛋白水平明顯升高，Tau蛋白和PHF1蛋白表達增加直接促進神經元纖維纏結的形成，這可能與AD的病理進程有一定關系。

阿爾茨海默病；Tau；配對螺旋樣纖維蛋白1；α7神經型尼古丁受體

阿爾茨海默病(AD)是一種神經元退行性變疾病，臨床上主要表現為進行性認知功能障礙和記憶力減退等〔1〕。病理學以細胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積形成的老年斑(SPs)以及神經細胞內tau蛋白過度磷酸化引起的神經元纖維纏結(NFTs)為主要特征〔2〕。高度磷酸化后的tau蛋白與微管分離，加速微管解聚，可自身聚集促進配對螺旋樣纖維(PHF)的形成〔3〕。PHF是NFT的主要成分，也是AD病理變化的基本元素〔4〕，PHF表達水平與Tau蛋白及Tau蛋白磷酸化程度密切相關，Tau蛋白過度磷酸化使游離Tau增多，游離Tau蛋白是形成PHF的前提基礎，二者共同加速NFT的形成。在AD患者大腦的海馬、皮質區，尼古丁受體數目減少，α7 亞單位蛋白表達明顯降低，α7神經型尼古丁受體(nAChR)與神經細胞毒性作用緊密相連〔5〕，在AD相關病變研究中發揮重要作用。本實驗用體外合成的α7 nAChR shRNA Plasmid(h)轉染神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，研究受體抑制后Tau蛋白和PHF1蛋白表達情況，探究α7 nAChR與Tau和PHF1蛋白之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的SH-SY5Y神經細胞由本課題組保存；穩定轉染α7 nAChR shRNA 表達質粒和空質粒的SH-SY5Y細胞由本課題組液氮保存；DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶購于Hyclone公司；嘌呤霉素購于Sigma公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；α7 nAChR、β-actin引物由上海生物工程有限公司設計并合成；RNA逆轉錄試劑盒購于Thermo公司；兔抗人Tau單克隆抗體(ab32057)、兔抗人PHF1單克隆抗體(ab184951)均購于英國Abcam公司；鼠抗人β-actin 單克隆抗體(M20010)購于美國Abmart公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(7074s)購于美國Cell Signaling公司；HRP標記的羊抗鼠二抗(ZB2305)購于中杉金橋公司，蛋白marker購于美國Thermo公司；5×蛋白上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增強化學發光法(ECL)-Plus發光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達公司。

1.2 細胞培養 空白組SH-SY5Y細胞以DMEM為培養基，其中添加10%胎牛血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，轉染α7 nAChR shRNA Plasmid (h)實驗組和轉染Control shRNA Plasmid-B空載體組SH-SY5Y細胞以添加13%胎牛血清、0.004 g/L嘌呤霉素的DMEM為培養基，置于含5% CO2的37℃恒溫箱中進行培養。

1.3 實時熒光定量PCR檢測α7 nAChR mRNA表達水平 采用Trizol一步法提取細胞總RNA，用RNA逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，并以此為模板進行實時熒光定量PCR。α7 nAChR和內參β-actin引物序列見表1，用ABI StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀采集α7 nAChR及內參β-actin擴增各循環熒光信號，用SDS2.1軟件收集熒光信息并分析相關資料，主要分析α7 nAChR ΔΔCt值及RQ值，RQ=2-ΔΔCt。計算沉默組與空載體對照組之間的相對水平。

1.4 Western印跡檢測α7 nAChR、Tau及PHF 1蛋白表達水平 按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制裂解液，收集細胞，用冷凍離心機12 000 r/min、4℃、15 min離心，吸取蛋白質上清液。采用二甲基哇啉(BCA)定量法測定蛋白濃度；運用Western印跡法檢測α7 nAChR、Tau和PHF1蛋白表達水平及其各自內參β-actin的蛋白表達情況。運用Image J 軟件進行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內對照，計算α7 nAChR、Tau、PHF1蛋白條帶相對其內參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達水平。每組蛋白復孔二個，進行三次獨立重復實驗。

1.5 統計學方法 應用SPSS22.0軟件行獨立樣本t檢驗。

表1 熒光定量PCR引物序列及產物片段

基因引物序列擴增片段長度(bp)α7nAChR5′accactcaccgtctacttctcc3′1675′tgatgtcgccgatgatgc3′β?actin5′tggcaccacaccttctacaatg3′1035′tcatcttctcgcggttggc3′

2 結 果

2.1 穩定轉染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細胞α7nAChR mRNA及其蛋白質表達水平 受體沉默組與空質粒組相比，α7nAChR mRNA〔(0.06±0.02)vs(1.05±0.06)〕和蛋白質水平〔(18±6) vs (104±5)〕分別降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)。說明穩定轉染α7 nAChR shRNA 表達質粒的SH-SY5Y細胞，α7 nAChR 在mRNA和蛋白質水平表達受到明顯抑制。

2.2 α7 nAChR基因沉默對Tau和PHF1蛋白表達水平的影響 受體沉默組與空質粒組相比，Tau蛋白〔(171±8)vs(104±14)〕和PHF1蛋白質〔(162±7)vs(102±9)〕水平分別升高了65%(P<0.01)和58%(P<0.05)。見圖1。

圖1 α7 nAChR基因沉默細胞Tau和PHF1蛋白表達水平

3 討 論

在AD的發展過程中，nAChR 扮演重要角色，通過對AD患者進行尸檢發現大腦皮層萎縮、nAChRs密度降低、數量減少〔6〕。給予α7nAChR特異性激動劑處理后，能減弱Aβ誘導的神經細胞凋亡，從而發揮一定的神經保護作用〔7〕。體外實驗證實在海馬神經元和大腦皮層神經元尼古丁能降低Aβ 聚集及其引起的神經毒性〔8〕；同時，用α7 nAChRs激動劑處理細胞，Tau蛋白磷酸化水平增高，而預先用α7 nAChRs阻滯劑處理后，Aβ誘導Tau蛋白磷酸化水平減弱〔9〕。采用RNA 干擾技術，沉默SH-SY5Y 細胞α7 nAChR，Aβ毒性作用可以明顯增強〔10〕，尼古丁受體對Aβ造成的毒性損傷具有一定的神經保護作用。另外，也有研究認為AD患者中α7 nAChR明顯減少，是由于其與Aβ相互作用所致并誘導神經元凋亡，因此猜測α7 nAChR激動劑可能會成為治療AD很好的藥物〔11〕。

近年來研究較多的AD主要病變特點之一NFT由Tau蛋白誘導形成，Tau蛋白是一種神經元微管相關細胞骨架蛋白，主要在神經元內表達，生物學功能以催化微管裝配和穩定微管結構為主。在AD患者腦內Tau蛋白主要存在三種形式，即細胞質正常Tau蛋白(C-Tau)，過度磷酸化易溶型Tau蛋白(ADP-Tau)和聚集成配對PHF的Tau蛋白(PHF-Tau)；在PHF-Tau中已發現45個磷酸化位點，主要是絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)殘基的磷酸化。Tau高度磷酸化后穩定性降低，不僅可以加速微管解體，自身聚集成PHF〔3〕，還能加快游離Tau蛋白在大腦和腦脊液中沉積形成細胞內NFT〔12〕。NFT通過損傷神經元、神經膠質細胞和tau蛋白功能等多種途徑導致強大的神經毒性。

Tau蛋白作為AD一種主要研究蛋白，在其他疾病中也逐漸被發現，目前已經證實有超過20種神經系統退行性疾病與Tau蛋白有關〔13〕。在與Tau相關的疾病中，幾乎都主要表現為Tau蛋白的磷酸化異常從而大量聚集形成NFT〔14〕。病理學相關研究發現AD患者出現癡呆的嚴重程度與其腦組織中的NFTs數量呈正相關〔15〕。在病理狀態下，Tau蛋白往往被異常磷酸化，高度磷酸化的Tau蛋白失去與微管的結合能力，微管結構不穩定，導致神經元骨架瓦解，引起AD發病，同時細胞內游離Tau蛋白增多，游離的異常磷酸化Tau蛋白彼此連接形成PHF，成對螺旋絲再相互纏繞成混合微絲，最后高度聚集形成NFT。也就是說，異常過度磷酸化Tau蛋白是PHF亞單位，PHF又作為NFT的主要組成成分逐步促成AD的病理發展。螺旋絲種類繁多，PHF1即為PHF中較為常見的一種，雖然目前PHF在AD的相關研究中提及不多，但其作為NFT形成的關鍵及主要元素，其對AD的發病研究有著更深刻的意義。實驗結果顯示，α7 nAChR基因表達沉默時，Tau蛋白和PHF1蛋白水平都明顯升高，說明α7 nAChR可以調節Tau和PHF蛋白的表達，從而影響NFT的形成過程，在AD的發病中起著重要作用。

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〔2016-05-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on level of Tau and PHF1 protein in SH-SY5Y cells

ZHOU Fei,ZHANG Shu-Li,LI Yi,et al.

The Key Laboratory of Molecular Biology Laborary, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China

Objective To investigate the influence of inhibited gene expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on the level of Tau and PHF1 proteins in SH-SY5Y cells and study the role of α7 nAChR in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD).Methods The level of α7nAChR mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of Tau and PHF1 were determined by Western blot.Results Compared with negative controls, the expression of α7nAChR at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells with α7 nAChR silencing were decreased by 94% and 82%, respectively. And the expression of Tau and PHF1 proteins were increased by 65% and 58%, respectively.Conclusions The inhibited gene expression of α7 nAChR by RNA interference may markedly stimulate the expression of Tau and PHF1 proteins, which directly might develop the formation of NFT, so the variation of Tau and PHF1 proteins induced by α7 nAChR gene silencing may be related to the pathogenesis of AD.

Alzheimer's disease;Tau;PHF1;α7 nAChR

國家自然科學基金資助項目(81360178)；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)；貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項目(201344，黔科合J字〔2012〕2055)

齊曉嵐(1976-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事老年性癡呆發病機制研究。

周 飛(1990-)，女，碩士，主要從事神經分子生物學研究。

R749.01

A

1005-9202(2016)24-6049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.001

1 貴州醫科大學第一附屬醫院神經外科