硫化氫對大鼠腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復的影響

石 磊 彭 翔 趙 炎 徐治強

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市普愛醫院神經外科，湖北 武漢 430034)

硫化氫對大鼠腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復的影響

石 磊 彭 翔 趙 炎 徐治強

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市普愛醫院神經外科，湖北 武漢 430034)

目的 探討硫化氫(H2S)對大鼠腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復的影響。方法 將75只350～400 g SD大鼠隨機分為對照組、模型組和H2S組，每組25只。模型組、H2S組大鼠行自體血腦內注入法建立腦出血動物模型，對照組僅行頭皮正中切口及暴露前囟而不行注射，H2S組于手術當日開始每日腹腔注射硫氫化鈉10 mg/kg，連續28 d，其余兩組僅腹腔注射等體積生理鹽水。分別于術后4、7、14、28 d對各組大鼠進行神經功能缺失體征評分及后肢運動功能Tarlov評分，術后14、28 d收集腦血腫周圍組織進行CD34免疫組化染色以計算微血管密度及血管場面積，分別采用免疫組化法和酶聯免疫吸附法檢測術后4、7、14、28 d的血腫周圍組織神經生長相關蛋白(GAP)-43和血管內皮生長因子(VEGF)水平。結果 對照組術后4、7、14、28 d的神經功能缺失體征評分及后肢運動功能Tarlov評分分別為0分和5分，提示神經功能和后肢運動功能正常。與對照組相比，模型組的神經功能缺失體征評分均升高，而Tarlov評分、血腫周圍微血管密度和血管場面積及血腫周圍組織VEGF水平和GAP-43陽性細胞數均降低(P<0.05)；腦血腫大鼠經H2S治療后以上指標獲改善，如H2S組的神經功能缺失體征評分低于模型組，Tarlov評分、血腫周圍微血管密度和血管場面積及血腫周圍組織VEGF水平和GAP-43陽性細胞數均高于模型組(P<0.05)，但H2S組以上指標與對照組的差異仍有統計學意義(P<0.05)。結論 H2S可促進大鼠腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復，可能與其增加腦血腫周圍組織VEGF水平及促進GAP-43表達有關。

硫化氫；腦血腫；血管新生；神經功能恢復

腦出血后形成的血腫壓迫及血腫分解的毒物是造成腦組織損傷的主要原因，而局部血管新生、微血管系統重建及神經元再生是改善預后的關鍵〔1，2〕。硫化氫(H2S)參與了多個系統的信號傳遞，被認為是繼NO和CO后第3類內源性氣體信號分子〔3〕。研究發現H2S具有促進神經損傷恢復的作用〔4,5〕，同時可通過KDR/mTOR/miR-640/HIF1α途徑促進血管新生〔6〕。以上提示H2S可能對腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復有一定的作用，但目前尚不清楚。本研究采用行為學評價及分子生物學手段研究H2S對大鼠腦血腫周圍血管新生及神經功能恢復的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，兔抗鼠CD34單克隆抗體購自博奧森公司，兔抗神經生長相關蛋白(GAP)-43抗體購自美國Abcam公司，血管內皮生長因子(VEGF)酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。儀器：Model 550型酶標儀購自Bio-Rad公司，BX51型顯微圖像采集系統購自日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗分組 將45只350～400 g SD大鼠(北京維通利華公司)隨機分為對照組、模型組和H2S組，每組15只。模型組、H2S組大鼠采用自體血腦內注入法建立腦出血動物模型，對照組不行任何手術操作；H2S組于手術當日開始每日腹腔注射硫氫化鈉10 mg/kg，連續28 d，其余兩組僅腹腔注射等體積生理鹽水。所有大鼠均于同一SPF級環境飼養，溫度(22±20)℃、濕度(50±10)%。

1.3 腦出血動物模型制備 4%水合氯醛腹腔麻醉后，俯臥位將大鼠固定于腦立體定位儀上，消毒頭皮后取正中切口，依次經骨膜剝離、暴露前囟及右側尾狀核定位后，采用牙科鉆穿透顱骨備用；距尾端3 cm處剪斷鼠尾后采用微量注射器抽取未抗凝血50 μl，借助立體定位儀進針，于尾狀核內緩慢注射，停針5 min后緩慢退出針頭，封閉顱骨創口后縫合頭皮。

1.4 行為學評價 分別于術后4、7、14、28 d對各組進行行為學評價，主要包括Longa 5 分評分法及Tarlov評分。Longa神經學檢查評分：0分：正常，無神經功能缺損；1分：癱瘓側前爪不能完全伸展，輕度神經功能缺損；2分：行走時，大鼠向癱瘓側轉圈，中度神經功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向癱瘓側傾倒，重度神經功能缺損；4分：不能自發行走，有意識喪失；5分：死亡。改良Tarlov評分標準：完全性癱瘓，0分；有肌肉自發性收縮，1分；關節活動好、但不能站立，2分；能站立、無法行走，3分；可行走，但晃擺，4分；正常，5分。每組每個時間點取8只。

1.5 腦血腫周圍血管新生情況評價 于術后14、28 d收集腦血腫周圍組織進行CD34免疫組化染色以計算微血管密度及血管場面積。經左心室4%多聚甲醛灌注后取出腦組織，依次經固定、脫水及石蠟包埋后，留取血腫周圍切片6張，采用免疫組化SP法在鏡下檢測CD34的陽性表達情況，其中血管內皮細胞膜棕黃色顆粒者為陽性，選取5個高倍視野(400倍)進行血管計數，取平均值為微血管密度，同時采用Image Pro Plus 5.1圖像分析系統測定血管場面積，最終結果表示為所測有效血管截面面積與統計場面積的比值。

1.6 血腫周圍組織的VEGF水平檢測 分別于術后4、7、14、28 d收集各組大鼠腦組織，分離腦血腫周圍組織，于冰上加入裂解液，研磨充分后以3 000 r/min離心10 min后收集上清液，采用BCA法測定上清液的蛋白含量后，采用試劑盒檢測組織中VEGF水平，操作過程嚴格遵循試劑盒說明書。

1.7 血腫周圍組織的GAP-43水平檢測 將1.6中收集的腦血腫周圍組織依次經固定、脫水及石蠟包埋后，留取血腫周圍切片6張，采用免疫組化SP法在鏡下檢測GAP-43陽性細胞，選取5個高倍視野(400倍)計數，取平均值作為GAP-43陽性細胞數。

1.8 統計學處理 采用SPSS20.0軟件。計量資料組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗。

2 結 果

2.1 各組不同時間點神經功能缺失體征評分情況 對照組術后各時點神經功能缺失體征評分均為0分，提示神經功能正常。與對照組相比，模型組的神經功能缺失體征評分均升高，且隨觀察時間延長而呈增長趨勢(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后神經功能缺失體征評分均改善，均低于模型組，但仍高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組不同時間點后肢運動功能Tarlov評分情況 對照組術后4、7、14、28 d的Tarlov評分均為5分，提示后肢運動功能正常。與對照組相比，模型組的Tarlov評分均降低，且隨觀察時間延長而呈下降趨勢(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后的后肢Tarlov評分均獲改善，均高于模型組，但仍低于對照組(P<0.05)。見表2。

組別4d7d14d28d模型組1 74±0 352 11±0 272 64±0 293 21±0 39H2S組1 16±0 241)1 09±0 311)0 73±0 221)0 89±0 171)

與模型組比較：1)P<0.05

2.3 各組大鼠血腫周圍的血管新生情況 與對照組相比，模型組術后14、28 d的微血管密度和血管場面積均降低(P<0.05)；腦血腫大鼠經H2S治療后的微血管密度和血管場面積均高于模型組，但仍低于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血腫周圍組織VEGF水平比較 與對照組相比，模型組術后4、7、14、28 d的VEGF水平均降低，且隨觀察時間延長而呈下降趨勢(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后VEGF水平均高于模型組，但仍低于對照組(P<0.05)。見表4。

組別4d7d14d28d對照組5555模型組3 25±0 411)2 74±0 341)1 65±0 221)0 54±0 091)H2S組3 76±0 291)2)4 37±0 411)2)4 42±0 341)2)4 63±0 281)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

組別微血管密度(個)14d28d血管場面積(%)14d28d對照組42 17±3 5539 72±4 316 84±0 927 26±0 75模型組27 06±2 911)16 38±2 201)4 15±0 611)2 05±0 821)H2S組32 64±3 621)2)22 91±2 741)2)4 73±0 541)2)4 45±0 561)2)

組別4d7d14d28d對照組27 91±3 4525 41±2 8729 62±2 7026 18±3 07模型組22 76±2 631)17 53±1 921)14 47±1 361)12 99±2 121)H2S組25 33±2 911)2)21 70±2 351)2)19 38±2 281)2)20 73±2 461)2)

2.5 各組大鼠血腫周圍組織GAP-43水平比較 與對照組相比，模型組術后4、7、14、28 d血腫周圍組織GAP-43陽性細胞數均降低，且隨觀察時間延長而呈下降趨勢(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后血腫周圍組織GAP-43陽性細胞數高于模型組，但仍低于對照組(P<0.05)。見表5。

組別4d7d14d28d對照組27 91±3 4525 41±2 8729 62±2 7026 18±3 07模型組22 76±2 631)17 53±1 921)14 47±1 361)12 99±2 121)H2S組25 33±2 911)2)21 70±2 351)2)19 38±2 281)2)20 73±2 461)2)

3 討 論

H2S是一種新型的氣體信號分子，具有較廣的心血管調節活性，如舒張血管、減輕心肌缺血再灌注損傷及調節心肌收縮能力等〔7〕。近年來發現，其在改善神經損傷上有一定效果，如傅智軼等〔4〕發現H2S對急性馬尾神經損傷模型大鼠具有神經保護作用，劉蓓蓓等〔5〕指出外源性H2S可減輕海馬神經元的氧糖缺失/恢復損傷，達到減輕細胞凋亡的效果，同時發現外源性H2S可能通過上調HIF-1α發揮保護作用。蔣莉等〔8〕亦發現外源性H2S對氧化應激導致的海馬神經損傷有較好的保護效果。此外，外源性H2S對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷具有保護作用〔9〕。以上結果提示外源性H2S具有一定神經保護作用，推測對腦出血血腫周圍的神經損傷可能有保護作用。

本研究采用自體血腦內注入法建立腦出血動物模型，嚴格篩選成模大鼠。行為學研究結果發現外源性H2S可改善腦出血大鼠的神經損傷，但術后28 d仍未達到正常水平，可能原因為藥物劑量不夠或者觀察時間較短，下一步將進行重點研究。血腫壓迫及血腫血液分解形成的有毒物質可損傷神經元，繼而引起神經功能學行為評價異常〔10〕，本研究推測外源性H2S可能對神經元損傷后再生有一定作用。GAP-43是新生神經元的標志物，其數量變化可反映神經修復情況〔11〕。免疫組化發現模型組大鼠的GAP-43陽性細胞數目低于正常水平，而外源性H2S處理后的GAP-43陽性細胞數升高，表明外源性H2S可促進血腫周圍神經修復，與之前的推測一致。

微血管系統重建為血腫后神經損傷修復提供了物質基礎，故研究血腫周圍血管新生情況對于評價外源性H2S的效果有重要意義。由于CD34可用于標記血管內皮細胞〔12〕，故本研究首選采用免疫組化法直接觀察血管新生情況，結果表明模型組大鼠經外源性H2S處理后的微血管密度和血管場面積均升高，表明外源性H2S可促進血腫周圍血管再生。VEGF是促進血管新生的關鍵因子〔13〕，與免疫組化的結果一致，外源性H2S可升高血腫周圍組織的VEGF水平，為證實外源性H2S可促進血腫周圍血管再生提供了分子學證據。外源性H2S可通過KDR/mTOR/miR-640/HIF1α途徑促進血管新生〔6〕，推測此通路可能參與了H2S對腦出血血腫周圍血管再生的促進作用。

1 呂 莉.早期微孔手術與內科保守治療對患者中小量基底節腦出血后腦水腫及預后影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(13):3754-5.

2 畢 勝，劉 群,范 佳,等.腦出血患者血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(12):3201-2.

3 孫 平,范仲凱,李昊天,等.硫化氫對大鼠急性脊髓損傷的保護作用〔J〕.天津醫藥,2015;43(11):1271-4.

4 傅智軼,劉興振,吳玉杰,等.硫化氫對急性馬尾神經損傷模型大鼠的神經保護作用〔J〕.中國組織工程研究,2014;18(49):7914-8.

5 劉蓓蓓,潘 昊,陳 娣,等.外源性硫化氫對大鼠海馬神經元氧糖缺失/恢復損傷的作用〔J〕.中華急診醫學雜志,2014;23(7):770-5.

6 周 瑜,張彩彩,李杏輝,等.硫化氫通過KDR/mTOR/miR-640/HIF1A途徑促進血管新生〔J〕.中國病理生理雜志,2015;(10):1828-30.

7 Haouzi P,Chenuel B,Sonobe T.High-dose hydroxocobalamin administered after H2S exposure counteracts sulfide-poisoning-induced cardiac depression in sheep〔J〕.Clin Toxicol (Phila),2015;53(1):28-36.

8 蔣 莉,張 平,羅 焱,等.硫化氫對慢性應激致大鼠海馬神經損傷的保護作用及機制〔J〕.中華行為醫學與腦科學雜志,2016;25(1):19-23.

9 魏楚蓉,劉路寬,田立兵,等.硫化氫對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷的保護作用〔J〕.中國病理生理雜志,2014;30(2):203-7.

10 吳 季,張海男,唐 濤,等.益氣活血法對腦出血大鼠血腫周圍新生血管內皮整合素α5亞基表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(22):4933-5.

11 Burello L,De Bartolo P,Gelfo F,etal.Functional recovery after cerebellar damage is related to GAP-43-mediated reactive responses of pre-cerebellar and deep cerebellar nuclei〔J〕.Exp Neurol,2012;233(1):273-82.

12 Menkova-Garnier I,Hocini H,Foucat E,etal.P2X7 receptor inhibition improves CD34 T-cell differentiation in HIV-infected immunological nonresponders on c-ART〔J〕.PLoS Pathog,2016;12(4):e1005571.

13 Boroujeni MB,Boroujeni NB,Gholami M.The effect of progesterone treatment after ovarian induction on endometrial VEGF gene expression and its receptors in mice at pre-implantation time〔J〕.Iran J Basic Med Sci,2016;19(3):252-7.

〔2016-03-19修回〕

(編輯 徐 杰)

石 磊(1978-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經外科疾病研究。

R651

A

1005-9202(2016)24-6058-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.005