胰升糖素樣肽-1受體激活對高糖誘導心肌肥大的抑制作用及其機制

陳 東 廖 偉

(贛南醫學院，江西 贛州 341000)

胰升糖素樣肽-1受體激活對高糖誘導心肌肥大的抑制作用及其機制

陳 東 廖 偉1

(贛南醫學院，江西 贛州 341000)

目的探討胰升糖素樣肽(GLP)-1受體激活對高糖誘導心肌肥大的抑制作用及其機制。方法 體外培養大鼠心肌細胞H9C2，將生長狀態良好的細胞隨機分為正常對照組(N組)，高糖組(H組)，高糖+Exendin-4組(E組)。干預48 h后采用Western 印跡法分別檢測各組細胞中心納素(ANP)、β-組織相容性復合體(MHC)、GLP-1、轉化生長因子(TGF)-β1、骨橋蛋白(OPN)表達情況。結果 高糖組ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表達較正常對照組明顯增高；Exendin-4干預后ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表達降低，但仍高于正常對照組。高糖組GLP-1蛋白表達較正常對照組明顯降低，Exendin-4干預后GLP-1蛋白表達增加，但仍低于正常對照組。結論 GLP-1受體激活可能是通過激活GLP受體，抑制TGF-β1、OPN的表達，從而在抗高糖誘導的心肌細胞肥大過程中起重要作用。

胰升糖素樣肽；高糖；心肌肥大；骨橋蛋白；轉化生長因子β

胰升糖素樣肽-1(GLP-1)是一種由腸黏膜L細胞分泌的腸促胰島素，不僅具有改善血糖控制的生理功能，還具有抗心肌細胞肥大、凋亡和抗纖維化的作用〔1〕。糖尿病心肌病的主要病理特征是心肌細胞肥大以及心肌間質纖維增生。研究證實高血糖和高胰島素是促進心肌肥厚的獨立因素〔2〕，高糖可誘導體外培養的心肌細胞肥大。本研究探討GLP-1受體激動劑Exendin-4對高糖誘導心肌肥大的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑 大鼠心肌細胞株H9C2購自中國科學院細胞庫。β-組織相容性復合體(β-MHC)抗體購自abcom公司；心納素(ANP)、GLP-1、辣根過氧化物酶抗體、HRP 標記的辣根過氧化酶二抗購自ABclonal公司；轉化生長因子(TGF)-β1抗體購自Bioss公司；β-actin抗體購自中山金橋公司。Exendin-4購自Sigma公司。胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司。DMEM、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMSO、RIPA 裂解液購自索萊寶公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天。增強型化學發光(ECL)顯影液購自天根公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養細胞，隔天換液1次，待細胞長至約占培養皿90%時，用PBS沖洗兩遍，加數滴0.25%胰酶，消化1～2 min，加含血清培養液終止消化，用槍頭輕輕吹打使細胞脫落，離心、重懸后按1傳3的比例分到新皿。

1.2.2 實驗分組 取狀態良好的細胞傳代進行實驗分組，隨機分為以下三組：①正常對照組(N組)：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；②高糖組(H組)：葡萄糖濃度為25.0 mmol/L；③高糖+Exendin-4(E組)：Exendin-4終濃度為50 nmol/L，葡萄糖濃度為25.0 mmol/L。48 h后行下一步實驗。

1.2.3 心肌細胞表面積測定 干預實驗結束后，取各組心肌細胞進行圖像采集，采用Image-Pro Plus軟件分析各組心肌細胞表面積，每組隨機取10個視野，每個視野測定10個細胞表面積，以正常對照組為參照，計算各組細胞相對表面積。每組重復5次。

1.2.4 心肌細胞蛋白含量檢測 將培養好的心肌細胞用PBS沖洗后，加入RIPA 裂解緩沖液，4℃，15 min 后用細胞刮收集細胞，4℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，在570 nm波長處檢測A值，計算單個心肌細胞蛋白含量(pg/cell)，每組重復5次。

1.2.5 Western印跡檢測各蛋白水平 取藥物處理48 h后的心肌細胞，冰上裂解細胞并提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，調整各組蛋白濃度至相同水平，各組取30～50 μg蛋白，進行十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉膜，封閉2 h，孵育以相應的一抗4℃過夜〔β-actin、ANP 1∶1 000；GLP-1、骨橋蛋白(OPN)、TGF-β 1∶400〕。孵育過夜后用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，而后加入相應HRP標記二抗于室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜，使用ECL發光并將膜置于暗盒內，壓上X光片，在暗室內曝光、顯影、漂洗、定影，晾干后對膠片進行拍照，使用Image J軟件進行積分光密度分析。結果以β-actin 為內參，計算各組各蛋白的相對表達量。每組重復3次。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行多組間單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間比較采用LSD法。

2 結 果

2.1 GLP-1受體激動劑對高糖誘導心肌肥大的抑制作用 與正常對照組〔心肌細胞表面積(661.84±35.46)μm2/cell,心肌細胞蛋白含量(650.84±44.31)pg/cell,ANP(0.997±0.104)、β-MHC(0.491±0.185)〕相比，高糖組心肌細胞表面積〔(959.88±39.86)μm2/cell〕、心肌細胞蛋白含量〔(948.90±62.05)pg/cell〕及ANP(1.581±0.185)、β-MHC(0.977±0.138)均明顯增加(P<0.05)。與高糖組相比，Exendin-4 處理48 h后明顯減輕高糖誘導的心肌細胞ANP(1.155±0.107)、β-MHC(0.758±0.173)的表達水平(P<0.01)和心肌細胞相對表面積〔(792.22±53.72)μm2/cell〕(P<0.01)及蛋白含量〔(750.14±48.34)pg/cell〕(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌細胞中ANP和β-MHC蛋白表達水平

圖2 各組心肌細胞中GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表達水平

2.2 GLP-1受體激動劑對高糖誘導的心肌肥大細胞GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表達的影響 與正常對照組相比〔TGF-β1:(0.710±0.212),OPN:(0.412±0.195),GLP-1:(2.642±0.102)〕，高糖組TGF-β1(1.178±0.163)和OPN(1.002±0.131)蛋白表達顯著上調(P<0.01)，GLP-1蛋白(0.770±0.147)表達降低(P<0.05)。Exendin-4干預可抑制TGF-β1(0.851±0.112)和OPN蛋白(0.857±0.168)的表達(P<0.01)，上調GLP-1蛋白(1.361±0.118)表達(P<0.05)。見圖2。3 討 論

心肌肥大是糖尿病心肌病的突出特征，而高血糖是誘導糖尿病性心肌肥大的主要因素之一〔3〕。本實驗表明Exendin-4干預后能減輕高糖誘導的心肌細胞肥大標志物的表達、心肌細胞蛋白含量及細胞面積，表明Exendin-4能抑制心肌肥大。目前認為，糖尿病心肌病心肌纖維化主要因素可能是高血糖導致的氧化應激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活以及TGF-β1表達增加等〔4〕。本研究提示TGF-β1/OPN信號通路參與心肌肥大過程。TGF-β1在心血管系統中表達廣泛，能誘導心肌細胞肥大和心臟成纖維細胞增殖以及細胞外基質的合成，引起心肌細胞肥大及間質纖維化。OPN是一種分泌型磷酸化的糖蛋白，屬于細胞外基質蛋白家族，又是一種具有促炎及促纖維化特性等多功能的細胞因子，可與多種配體相結合，發揮相應的生物學效應。正常情況下，心臟OPN表達水平較低，然而在許多病理情況下，如急性心肌梗死后及慢性壓力負荷下小鼠心肌細胞OPN表達增強；在心肌肥大時OPN 在心肌細胞中呈高表達狀態〔5〕。隨著糖尿病心肌病和心衰病程的進展，OPN的表達也明顯增多〔6〕。Subramania等〔7〕的研究顯示糖尿病小鼠心肌組織OPN表達增加，纖維化程度明顯，而敲除OPN基因后，心肌纖維化減輕，凋亡減少，心功能也得到了改善。這些報道與本實驗高糖誘導心肌肥大后OPN的表達增多結果相一致，說明OPN參與了高糖誘導心肌肥大的發生發展過程。研究〔8〕發現OPN基因的啟動子有TGF-β的結合元件，提示OPN

可受TGF-β的調控。也有文獻報道TGF-β1下游信號蛋白Smad3 與OPN 基因啟動子結合，Smad4 與阻遏蛋白結合并使之移位，從而促使OPN mRNA轉錄，OPN 可能是TGF-β1 的下游分子〔9〕。在大鼠腎上皮細胞系NRK52E的研究中發現，TGF-β1可上調OPN基因轉錄〔10〕。在人肝星狀細胞系中TGF-β1通過其下游Runt相關轉錄因子(RUNX2)作用于OPN 啟動子區域促進OPN表達〔11〕。另有報道提示，在哮喘和成骨細胞分化等病理生理過程，OPN都與TGF-β1通路密切相關。但是，也有研究〔12〕顯示OPN具有調節TGF-β1 激活作用。

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8 He D，Wang S，Jia Z，etal.Calcium ions promote primary renal epithelial cell differentiation into cells with bone-associated phenotypes via transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in idiopathic hypercalciuria patients〔J〕.Mol Med Rep，2015；11(3)：2199-206.

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10 李 珺，董吉祥.骨橋蛋白與糖尿病腎病〔J〕.國外醫學·內分泌學分冊，2005；25(2)：126-8.

11 王 睿，蕭 笑.TGF-β1通過RUNX2調控人肝星狀細胞系LX-2中骨橋蛋白表達〔J〕.現代生物醫學進展，2013；13(35)：6801-5.

12 Driver J，Weber CE，Callaci JJ，etal.Alcohol inhibits osteopontin-dependent transforming growth factor-beta1 expression in human mesenchymal stem cells〔J〕.J Biol Chem，2015；290(16)：9959-73.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金資助項目(No.81360030)

廖 偉(1965-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事代謝性疾病研究。

陳 東(1990-)，男，在讀碩士，主要從事代謝性疾病研究。

R542

A

1005-9202(2016)24-6061-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.006

1 贛州市衛計委