下丘腦室旁核微量注射精氨酸血管加壓素對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響

李春穎 徐兆忠 李 菁 崔雅惠 崔 影 曲 嫻

(北華大學基礎醫學院，吉林 吉林 132013)

下丘腦室旁核微量注射精氨酸血管加壓素對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響

李春穎 徐兆忠1李 菁 崔雅惠1崔 影1曲 嫻

(北華大學基礎醫學院，吉林 吉林 132013)

目的探討下丘腦室旁核(PVN)微量注射精氨酸血管加壓素(AVP)對血管性癡呆(VD)大鼠的學習記憶功能的影響及可能機制。方法 采用2-VD方法復制VD模型；2 w后PVN注射AVP，采用Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力，用放射免疫分析測定AVP含量，用熒光分光光度法測去甲腎上腺素(NE)含量。結果 PVN注射AVP可以改善VD大鼠學習記憶能力，海馬AVP及NE含量增多。結論 VD的發生可能與下丘腦釋放的AVP量減少導致大腦海馬內AVP及NE含量減少有關。

血管性癡呆；下丘腦室旁核；精氨酸血管加壓素

血管性癡呆(VD)的發生與海馬有關〔1～3〕。實驗表明下丘腦室旁核(PVN)對海馬有直接的神經纖維聯系；順行示蹤實驗發現海馬可直接投射到PVN〔4〕，在結構上海馬與PVN之間存在往返神經纖維聯系，是精氨酸血管加壓素(AVP)的重要作用靶點，同時海馬也可調節AVP分泌。損傷海馬和顯微注射發現AVP可作用于海馬齒狀回,影響PVN內AVP mRNA的水平〔4〕。研究表明AVP具有增強學習記憶能力、促進回憶過程的生理效應〔5〕。VD的發生是否通過PVN調節AVP釋放有關，國內尚無報道。本研究通過PVN微量注射AVP觀察其能否改善VD大鼠學習記憶功能并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性健康SPF級Wistar大鼠，體重220～240 g，由吉林大學的實驗動物中心所提供，動物許可證號：SCXK(吉)2007-0003。動物飼養環境溫度(22±1)℃，濕度40%～50%，光照、黑暗各12 h，光照時間為7：00～19：00。AVP注射液由百靈威科技有限公司提供。AVP放免試劑盒由北方試劑研究所提供。

1.2 實驗分組 將50只Wistar大鼠隨機分為5組：正常組、假手術組、模型組、模型+腦脊液組、模型+AVP組(AVP組)，每組10只。正常組不作處理。假手術組：只分離頸總動脈，套絲線扣，但不阻斷血流。模型組：制備模型。ACSF組：建模后下套管，2 w后注射ACSF(2.0 μl)，1次/d，連續7 d。AVP組：建模后下套管，2 w后注射AVP(600 ng，2.0 μl)，1次/d，連續7 d。所有大鼠均進入最終結果分析。

1.3 動物模型的制備及注射套管安放 選用雄性Wistar大鼠，采用2-VD方法制備VD模型。以10%水合氯醛(按0.35 ml/100 g體重)行腹腔麻醉，仰臥固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈(CCA)。腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg(用無菌蒸餾水溶解)后，動脈夾夾閉CCA 10 min，再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，將大鼠固定于立體定位儀上，手術區皮膚消毒，按照大鼠腦立體定位圖譜，暴露顱骨，在PVN(前囟后-1.08 mm，中線旁左右旁開0 mm，深度7.0 mm)安置不銹鋼導藥管，牙科粉固定于顱骨表面，術后腹腔注射抗生素。放回籠中保溫飼養。

1.4 微注射給藥方法 在清醒狀態下進行注射，通過微量注射泵以0.2 μl/min的速度通過引導管向核團內各注射AVP或ACSF,留針2 min以防藥液流出。行為學實驗完畢后用微量注射器注射滂胺天藍溶液0.2 μl，標記微量注射下丘腦室旁核的位置。腹腔注射過量麻醉藥處死動物，取腦置于40%甲醛溶液中固定1 d，第二天做冠狀切片鑒定下丘腦室旁核的位置。

1.5 Morris水迷宮實驗 圓形水池(直徑80 cm)中放置一低于水面1 cm的平臺，并且平臺位置不能改變。水溫保持在(25±2)℃。安靜環境，實驗總計進行6 d，第1～5天進行定位航行實驗，從東、南、西、北4個入水點將大鼠背對平臺輕輕地放入水池內，同時開始記錄，每次間隔30 s。從大鼠入水到找到平臺所需的時間即為大鼠找到平臺的潛伏期。將4次潛伏期時間的平均值作為每天大鼠尋找平臺的潛伏期。如果大鼠在120 s內沒有找到平臺，大鼠的潛伏期按120 s計算。于實驗第6天進行空間探索實驗，平臺撤出，從平臺的對角線將大鼠處放入水迷宮，記錄大鼠在平臺所在象限所用的時間即穿越有效區的時間和120 s內穿越平臺的次數。

1.6 AVP含量 大鼠快速斷頭，取全腦，放入煮沸的生理鹽水，5 min后取出，用濾紙吸干附著的液體后，分離大腦皮層和海馬，分別稱重后加入1 mol/L HCl 1 ml，勻漿后倒入EP管中，室溫放置100 min，再加入1 mol/L NaOH 1 ml，4℃離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液，置-70℃冰箱保存待測。采用放射免疫分析法測定AVP含量。操作嚴格按藥盒說明書進行，并根據標準曲線求得標本實際濃度。

1.7 NE含量 大鼠快速斷頭，取海馬，稱重，勻漿，用熒光分光光度法測NE含量。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析，并使用GraphPad Prism 6軟件處理圖片。

2 結 果

2.1 定位航行實驗 各組大鼠隨著訓練天數的增加尋找平臺的潛伏期也明顯縮短。和正常組比，假手術組大鼠尋找平臺的潛伏期兩組間無顯著差異，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期均明顯的延長(P<0.05)；與模型組比較，ACSF組大鼠尋找平臺的潛伏期、穿越有效區時間以及穿越平臺的次數無顯著差異(P>0.05)；與ACSF組大鼠比較，AVP組大鼠尋找平臺的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2 大鼠空間探索實驗結果 與正常組比較，假手術組大鼠穿越有效區時間以及穿越平臺的次數無顯著差異(P<0.05)，模型組大鼠穿越有效區時間明顯縮短(P<0.05)，穿越平臺的次數減少(P<0.05)；與模型組比較，ACSF組大鼠穿越有效區時間以及穿越平臺的次數無顯著差異(P>0.05)；與ACSF組大鼠比較，AVP組大鼠穿越有效區時間明顯延長(P<0.05)，穿越平臺的次數增多(P<0.05)，見表2。

2.3 大腦海馬內AVP含量 與正常組大鼠比較，假手術組大鼠海馬內AVP含量沒有顯著性差異，模型組大鼠AVP含量明顯減少；與模型組比較，ACSF組大鼠海馬內AVP含量無顯著差異(P>0.05)；與ACSF組比較，AVP組大鼠海馬內AVP含量明顯高于ACSF組(P<0.05)，見表2。

2.4 大腦海馬內NE含量 與正常組大鼠比較，假手術組大鼠海馬內NE含量無顯著性差異，模型組大鼠NE含量明顯減少；與模型組比較，ACSF組大鼠海馬內NE含量差異無顯著性；與ACSF組比較，AVP組大鼠大海馬內NE含量明顯高于ACSF組(P<0.05)，見表2。

組別第1天第2天第3天第4天第5天正常組38±132±222±317±315±4假手術組33±229±425±419±414±2模型組60±11)56±41)43±31)36±31)33±51)ACSF組62±158±346±338±536±4AVP組45±12)42±22)35±42)29±42)20±32)

與正常組比較：1)P<0.05；與ACSF組比較：2)P<0.05，下表同

組別穿越有效區時間(s)穿越平臺次數(次)AVP(pg/mg)NE(ng/g)正常組23±211±16 33±0 24755 22±18 18假手術組21±29±26 11±0 33814 53±28 69模型組10±11)4±11)1 99±0 291)508 67±29 351)ACSF組9±23±12 81±0 23530 67±30 17AVP組18±32)8±12)5 84±0 662)699 88±29 142)

3 討 論

目前實驗室中反映動物智力水平最可靠的指標是學習記憶能力。本實驗采用Morris水迷宮方法檢測大鼠的學習和記憶的能力。此實驗主要檢查的是動物的空間辨別能力，優點是能夠排除糞便或尿液及所分泌的一些激素的影響，能夠使檢測結果更加可靠〔6〕。本研究提示，模型組及ACSF組大鼠學習記憶能力下降，與文獻報道相一致〔7〕，注射AVP可改善這種狀況。AVP具有抗利尿、縮血管、加強記憶、參與體溫、維持晝夜節律及免疫調節等生理功能，同時還是學習和記憶的調節器，能夠加工信息，加強鞏固記憶和形成條件反射等〔8〕。腦內有許多部位分布AVP受體，如海馬結構、杏仁核、下丘腦外側區(LHA)等〔9〕海馬結構參與學習記憶的調節〔10〕，對缺血缺氧十分敏感〔11〕。海馬注射AVP可以改善大鼠的空間學習記憶能力〔12〕。本實驗提示，模型組及ACSF組海馬內AVP含量明顯下降，而AVP組大鼠AVP含量增高。NE可能是通過抑制興奮性毒性神經遞質及活性催化過程對神經元起保護作用的。研究表明全腦反復缺血再灌注大鼠腦內皮層和海馬NE含量都有不同程度降低〔13〕。本實驗結果顯示，模型組及ACSF組大腦皮質及海馬NE含量明顯下降，而AVP組大鼠NE含量增高。綜上，反復缺血再灌注導致VD的發生，這可能與下丘腦釋放的AVP減少導致大腦皮質及海馬內AVP及NE含量減少有關，這些可能是造成VD模型大鼠發生學習記憶能力減退的原因。

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〔2015-03-18修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

吉林省衛生廳項目(No.2010Z102；2015Q033)；吉林省教育廳項目(No.2015168)

曲 嫻(1964-)，女，教授，碩士生導師，主要從事神經生理學研究。

李春穎(1981-)，女，講師，博士，主要從事神經生理學研究。

R749.13

A

1005-9202(2016)24-6073-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.012

1 北華大學附屬醫院