姜黃素對5/6腎切除鼠鞘氨醇激酶1和轉化生長因子-β1表達的影響

袁紅霞 邱振宇 周 盾

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

姜黃素對5/6腎切除鼠鞘氨醇激酶1和轉化生長因子-β1表達的影響

袁紅霞 邱振宇 周 盾

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

目的探討姜黃素對5/6腎切除大鼠腎臟損害的保護作用及相關機制。方法 將36只SD大鼠隨機分為對照組，5/6腎切除組和姜黃素治療組，每組12只。10 w后檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)的水平；光鏡觀察各組大鼠腎組織病理改變，免疫組化法檢測腎組織鞘氨醇激酶(SPHK)1和轉化生長因子(TGF)-β1的表達。ELISA檢測各組大鼠血清中TGF-β1的分泌水平。結果 姜黃素治療組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平明顯低于5/6腎切除組(P<0.05)。免疫組化檢測可見5/6腎切除組大鼠SPHK1和TGF-β1表達明顯增加(P<0.05)，姜黃素治療組上述指標的表達均受到明顯抑制(P<0.05)。姜黃素治療組大鼠血清TGF-β1的分泌水平明顯低于5/6腎切除組，但仍高于對照組(P<0.05)。結論 姜黃素能減輕5/6腎切除大鼠腎臟病理改變，其機制可能是通過抑制TGF-β1的表達和分泌，進而影響SPHK1的表達而發揮作用。

姜黃素；5/6腎切除；鞘氨醇激酶1；轉化生長因子-β1

腎小球硬化、腎小管間質纖維化是各種腎臟疾病發展至終末期的不可逆病變，其間涉及炎性細胞浸潤、細胞因子活化、細胞增殖及細胞外基質聚集等錯綜復雜的病理生理過程〔1〕。姜黃素是從姜科植物根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、抗炎、促進免疫調節等藥理作用。近年研究顯示，姜黃素具有抗腎纖維化的作用〔2～4〕。本實驗通過建立5/6腎切除大鼠動物模型，觀察大鼠腎組織鞘氨醇激酶(SPHK)1和轉化生長因子(TGF)-β1的表達及姜黃素對其表達的影響。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑 健康成年雄性SD大鼠36只(遼寧醫學院實驗動物中心提供)，體質量250～300 g。姜黃素(Sigma公司)，兔抗大鼠SPHK1多克隆抗體(Abgent公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz公司)，SP免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。大鼠血清TGF-β1 ELISA試劑盒(沈陽博瑞德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 大鼠適應性飼養1 w后，隨機分為3組：對照組，5/6腎切除組和姜黃素治療組，每組12只。5/6腎切除組大鼠在麻醉和無菌條件下切除左腎上、下極約2/3腎組織,術后1 w，麻醉下切除右腎，兩次手術共切除腎臟約5/6。姜黃素治療組處理方法同5/6腎切除組，并于第2次腎切除后1 w開始行姜黃素150 mg·kg-1·d-1灌胃10 w。對照組和5/6腎切除組給予等體積飲用水灌胃。

1.2.2 標本采集與處理 10 w后，代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量；靜脈采血5 ml檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的水平及TGF-β1的分泌水平，后處死各組大鼠，留取腎臟組織標本，用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切片。①24 h尿蛋白定量：雙縮脲法檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量。②腎功能指標：全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清血SCr和BUN水平。③組織學檢查：取各組大鼠腎組織標本石蠟切片行HE和PAS染色，觀察腎組織病理形態學改變。④免疫組織化學檢測SPHK1和TGF-β1：采用SP法。石蠟切片4 μm。陰性對照用PBS代替一抗，檢測SPHK1和TGF-β1的表達。結果進行半定量分析，每張標本隨機選取5個視野，計算視野內染色區域的平均吸光度，以均值計算每個標本的吸光度，最后以每組的均值進行比較。⑤酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TGF-β1的水平：按照試劑盒提供的操作步驟進行實驗。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 干預后各組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平 干預10 w后，與對照組相比，5/6腎切除組24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平均明顯增加(P<0.05)。與對照組相比，姜黃素治療組24 h尿蛋白定量、SCr和BUN水平仍增高，但較5/6腎切除組顯著降低(P<0.05)。見表1。

組別24h尿蛋白定量(mg/24h)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)對照組12 63±6 425 44±1 2254 00±5 295/6腎切除組177 30±13 011)10，20±1 171)98 50±13 991)姜黃素治療組85 33±9 071)2)7 74±1 151)2)69 75±8 661)2)

與對照組比較:1)P<0.05；與5/6腎切除組比較：2)P<0.05,下表同

2.2 各組大鼠腎組織病理改變 HE和PAS染色結果顯示，對照組大鼠腎小球毛細血管襻開放較好，腎小管上皮細胞排列整齊，間質無明顯改變。5/6腎切除組可見腎小球系膜細胞增生，腎小囊擴張，囊壁增厚，球囊粘連，毛細血管襻面積縮小；腎小管閉塞，腎小管上皮細胞腫脹、顆粒變性、壞死、脫落，腎小管擴張明顯，可見蛋白管型，個別小管萎縮，可見間質纖維化和炎性細胞浸潤。姜黃素治療組病變較5/6腎切除組明顯減輕。見圖1。

2.3 各組大鼠腎組織中SPHK1和TGF-β1的表達 對照組大鼠腎小球和腎小管可見少量SPHK1和TGF-β1染色顆粒，5/6腎切除組SPHK1和TGF-β1表達明顯增加，姜黃素治療組SPHK1和TGF-β1蛋白表達與之相比明顯減少，但高于對照組(P<0.05)。見表2，圖2、圖3。

2.4 各組大鼠血清TGF-β1水平 5/6腎切除組TGF-β1水平〔(249.5±45.33)pg/ml〕和姜黃素治療組〔(115.7±38.52)pg/ml〕明顯高于對照組〔(50.18±20.54)pg/ml,P<0.05〕；與 5/6腎切除組比較，姜黃素治療組TGF-β1水平降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腎組織HE和PAS染色(×400)

表2 各組大鼠腎組織SPHK1和TGF-β1的表達

圖2 各組大鼠腎組織SPHK1的表達(×200)

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達(×200)

3 討 論

本實驗采用SD大鼠5/6腎切除誘導腎小球硬化模型，10 w后觀察到血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量升高，光鏡觀察腎小球系膜細胞增生，系膜基質增多，毛細血管襻面積縮小；腎小管閉塞，個別小管萎縮，可見間質纖維化。說明本實驗所采用的模型已出現腎小球硬化的病理改變。

1磷酸鞘氨醇(S1P)作為SPHK1的下游代謝產物，能調節細胞增殖、分化、遷移、接觸和黏附、存活以及血管的形成，調控多種細胞的生物學活性〔5,6〕。最近，越來越多的研究證實，SPHK1在糖尿病腎病、多囊腎等腎臟病變腎組織表達增加并促進腎臟硬化〔7～9〕。本研究發現，對照組大鼠腎組織中可見少量SPHK1表達，5/6腎切除組SPHK1表達明顯增加，說明SPHK1參與了腎局灶硬化和腎小管擴張，但具體機制不清。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用。國外學者研究發現，在5/6腎切除誘導的慢性腎衰竭模型大鼠中，姜黃素能顯著降低SCr、BUN及尿蛋白的水平，減輕腎局灶硬化和腎小管擴張〔3,10〕，這與本實驗的研究結果相一致。Ghosh等〔4〕在糖尿病腎病模型中研究發現，姜黃素能明顯下調SPHK1的表達和活性，使TGF-β1的過度表達受到抑制。另有研究證實，TGF-β1能促進SPHK1的活性和表達，促使細胞外基質的沉積〔11〕。TGF-β1是導致動物腎臟纖維化的關鍵性細胞因子，它能促進系膜細胞肥大，細胞外基質增多、降解減少，最終導致腎小球硬化。本研究發現，在5/6腎切除組大鼠腎組織中TGF-β1表達增多，血清分泌水平升高，提示TGF-β1和SPHK1可能共同參與了腎組織的病變。給予姜黃素治療后，大鼠腎組織中SPHK1和TGF-β1的表達減少，血清中TGF-β1的分泌水平顯著下降，說明姜黃素通過TGF-β1/SPHK1通路起到了對5/6腎切除大鼠腎臟的保護作用。

綜上，本研究表明姜黃素能改善5/6腎切除大鼠受損的腎臟結果和功能，降低蛋白尿，延緩慢性腎功能衰竭的發生和發展。其腎臟保護作用的機制可能是抑制TGF-β1的表達和分泌，進而影響SPHK1的表達而發揮作用。

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10 Ghosh SS,Krieg R,Massey HD,etal.Curcumin and enalapril ameliorate renal failure by antagonizing inflammation in 5/6 nephrectomized rats:role of phospholipase and cyclooxygenase〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2012;302(4):F439-54.

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〔2015-06-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

遼寧省教育廳科研項目(No.L2012312)

周 盾(1967-)，女，教授，碩士，碩士生導師，主要從事腎小球硬化的發病及機制研究。

袁紅霞(1979-)，女，講師，博士，碩士生導師，主要從事感染與免疫性疾病的發病機制及治療研究。

R59

A

1005-9202(2016)24-6093-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.022