槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞增殖及周期的影響

魯明騫 盧宏達 許新華 盧忠心 孔慶志 雷 章 徐冰清 李穎琦3

(湖北中醫藥大學臨床學院，湖北 武漢 430061)

槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞增殖及周期的影響

魯明騫1盧宏達2許新華1盧忠心2孔慶志2雷 章2徐冰清1李穎琦3

(湖北中醫藥大學臨床學院，湖北 武漢 430061)

目的研究槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞增殖及周期的影響。方法 制備濃度為0、3、6、9 mg/ml的槐耳清膏與人肺腺癌A549細胞作用后，采用流式細胞檢測觀察細胞凋亡率，并分析藥物干預36 h對細胞周期和細胞凋亡率的影響。結果 流式細胞術檢測結果顯示，槐耳清膏各濃度組均可發生細胞凋亡，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。各濃度組可使人肺腺癌A549細胞G0/G1、S期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增多。結論 槐耳清膏能誘導人肺腺癌A549細胞增殖，可能與細胞被阻滯于G2/M期有關。

槐耳清膏； 人肺腺癌A549細胞； 細胞增殖； 細胞周期

肺癌的治療以手術治療為主，由于缺乏早期癥狀和特異性診斷手段，大多數患者在確診時已屬中晚期而不能或無法手術〔1～3〕，雖然放療、化療和靶向藥物能使少數病人獲益，但因其毒副反應的限制，尋找新的藥物或治療方法是肺癌治療迫切需要解決的首要任務。中西醫結合治療肺癌已成為重要的治療手段〔4〕。細胞凋亡在惡性腫瘤的發生、發展中具有重要的作用〔5〕，槐耳主要活性成分為槐耳蛋白多糖，能誘導多種惡性腫瘤細胞的凋亡〔6～9〕。本實驗探討不同濃度槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞體外凋亡及周期的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物制備 槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業有限公司提供，用無血清PRMI-1640培養液100 ml溶解槐耳清膏10 g，制備成濃度為0、3、6、9 mg/ml的槐耳清膏溶液待用，0 mg/ml作對照組。

1.2 細胞株 人肺腺癌A549細胞株由武漢市中心醫院實驗室冷凍保存，10%胎牛血清、1%雙抗高糖DMEM培養，每2～3天進行傳代1次，讓細胞處于呈對數生長。

1.3 細胞凋亡及細胞周期檢測 不同濃度槐耳清膏與呈對數生長的人肺腺癌A549細胞共同培養24、36、48 h后，清洗固定，離心加入100 μl磷酸二氫鈉/檸檬酸緩沖液室溫震蕩30 min，然后加入100 mg/L核糖核酸酶A(RnaseA)和25 mg/L碘化丙啶(PI)染色液1 ml，4℃染色3 h，用FACSort流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞增殖的影響 槐耳清膏各濃度組與A549細胞作用后均可發生細胞凋亡，在濃度為3、6、9 mg/ml作用24、36 h、48 h后細胞凋亡率，與對照組(0 mg/ml)相比較有統計學差異(P<0.05)，見表1。

濃度(mg/ml)24h36h48h02 1±0 43 2±0 62 5±0 3314 5±4 31)37 2±3 61)20 2±1 51)611 5±1 51)27 8±3 11)15 4±1 61)99 6±1 31)24 7±2 61)12 5±1 61)

與0 mg/ml比較：1)P<0.05

2.2 槐耳清膏對人肺腺癌A549細胞周期的影響 槐耳清膏作用于人肺腺癌A549細胞36 h后，流式細胞儀測定細胞周期分布，槐耳清膏濃度為 3、6、9 mg/ml使細胞處于G0/G1期S期細胞比例分別比較對照組減少，G2/M期細胞比例增多，見表2。

表2 槐耳清膏各濃度組對A549細胞周期的影響(%，n=4)

組別(mg/ml)G0/G1SG2/M057 1641 870 97342 5447 629 84646 2347 256 52955 6142 781 61

3 討 論

槐耳是我國重要的藥用真菌類抗腫瘤藥物之一，分布于河北、山東、陜西等地，由于野生資源稀缺，近年來江蘇等地采用固體發酵法培養槐栓菌以供藥用，研究發現槐耳清膏具有獨特的抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，且毒性較小，對人體主要臟器無明顯不良損害。國內外研究表明，槐耳清膏能抑制乳腺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、骨髓瘤等多種腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡〔10～14〕。

凋亡抑制基因、凋亡促進基因及凋亡效應基因的上調和下調，都可能打破細胞生成和死亡的平衡〔15〕，隨著槐耳清膏濃度的增加，細胞抑制率反而下降，證明槐耳清膏濃度在3 mg/ml時抑制作用最強。槐耳清膏與A549細胞作用36 h時抑制作用達到高峰，隨著作用時間的延長，其抑制率逐漸下降，證明36 h是槐耳清膏作用最強的時刻。

細胞周期在正常細胞及腫瘤細胞中均有重要作用，王震等〔16〕在研究重樓皂苷對耐鉑人肺腺癌A549/DDP細胞增殖發現，重樓皂苷有促凋亡現象，細胞阻滯于G2期。本研究結果顯示，槐耳清膏對A549細胞的增殖抑制作用可能與其導致G2/M期細胞阻滯有關。

崔洋等〔17〕在研究槐耳清膏對骨肉瘤MG63細胞時發現，在藥物作用24 h和48 h后細胞活力均升高，而72 h細胞活力反而降低，與本實驗結果相似。Zhang等〔18〕研究發現槐耳清膏可以使乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231細胞的周期阻滯在G2期，進一步分析發現其機制可能通過bax-/bcl-2途徑促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。綜上所述，槐耳清膏能顯著抑制人肺腺癌A549細胞的增殖，濃度為3 mg/ml作用36 h后其抑制率能力最強。槐耳清膏可以使人肺腺癌A549細胞阻滯于G2/M期，從而使細胞周期阻斷，達到抑制細胞增殖的目的，但其機制仍需進一步深入探討。

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〔2015-09-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖北省教育廳重點項目(D20141205)；宜昌市科技研究與開發項目(A12301-03)

孔慶志(1953-)，男，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事腫瘤中西醫結合臨床及基礎研究。

魯明騫(1973-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤中西醫結合臨床及基礎研究。

R287

A

1005-9202(2016)24-6099-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.025

1 三峽大學第一臨床醫學院腫瘤研究所 宜昌市中心人民醫院腫瘤內科

2 武漢市中心醫院 武漢市腫瘤研究所 3 沈陽醫學院