老年糖尿病腎病患者轉化生長因子β1基因表達調控區甲基化改變及機制

金 琳 王海萍

(山東大學附屬省立醫院內科及心血管中心，山東 濟南 250000)

老年糖尿病腎病患者轉化生長因子β1基因表達調控區甲基化改變及機制

金 琳 王海萍

(山東大學附屬省立醫院內科及心血管中心，山東 濟南 250000)

目的觀察老年糖尿病腎病患者轉化生長因子(TGF)β1基因表達調控區甲基化改變情況，探討甲基化在糖尿病腎病發病機制中的作用。方法 老年2型糖尿病患者182例，分為單純糖尿病組84例、糖尿病腎病組98例，選取同期體檢的老年健康志愿者60名為健康對照組。提取3組外周血基因組DNA，進行亞硫酸氫鹽修飾處理。采用甲基化特異性PCR技術初篩3組TGF-β1基因表達調控區DNA甲基化人群，用亞硫酸氫鹽修飾后測序技術檢測3組TGF-β1基因表達調控區DNA甲基化水平。ELISA法檢測3組血清TGF-β1蛋白表達水平；分析糖尿病腎病組TGF-β1蛋白表達相關影響因素。結果 單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1基因第一外顯子區甲基化比例均明顯低于健康對照組(P<0.05)，糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進一步降低。單純糖尿病組甲基化水平明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病甲基化水平明顯低于健康對照組和單純糖尿病組(P<0.05)。單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1蛋白水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進一步升高。血清TGF-β1蛋白表達水平與UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明顯正相關，與eGFR、基因甲基化呈明顯負相關。進一步多元逐步回歸分析顯示，eGFR和基因甲基化與血清TGF-β1蛋白表達水平存在明顯相關性，是影響TGF-β1表達的因素。血清TGF-β1蛋白表達水平與病理分級呈明顯正相關；糖尿病腎病組12個CpG位點甲基化含量與病理分級相關。結論 TGF-β1基因表達調控區甲基化是高糖誘導系膜細胞 TGF-β1基因表達激活的重要機制，參與老年糖尿病腎病的發生與發展。

糖尿病腎病；DNA甲基化；轉化生長因子β1

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發癥，是終末期腎病的主要原因之一〔1〕。研究顯示，糖尿病腎病發生率與患者年齡和糖尿病持續時間呈正相關〔2〕。轉化生子因子(TGF)-β1是介導糖尿病腎病腎小球硬化的主要細胞因子，TGF-β1基因激活是糖尿病腎病早期系膜細胞轉分化的關鍵。研究發現，表觀遺傳學改變可能是糖尿病腎病發生、發展過程中環境與遺傳因素相互作用的橋梁，特別是基因表達調控區DNA甲基化可能參與病情的發生發展過程〔3〕。本研究使用甲基化特異性PCR技術(MSP)和亞硫酸氫鹽修飾后測序技術(BSP)檢測TGF-β1基因表達調控區DNA甲基化情況，旨在闡明甲基化變化在糖尿病腎病發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月本院收治的2型糖尿病老年患者182例。根據UACR水平分為單純糖尿病組(UACR<30 μg/mg)84例和糖尿病腎病組(UACR>30 μg/mg)98例，選取同期在本院體檢的老年健康志愿者60例為健康對照組。單純糖尿病組中男40例，女44例；年齡60～78歲，平均(67.82±8.50)歲；空腹血糖(FPG)(6.39±0.95)mmol/L。糖尿病腎病組中男48例，女50例；年齡60～76歲，平均(66.51±9.37)歲；FPG(6.77±1.05)mmol/L。健康對照組中男26例，女34例；年齡60～75歲，平均(64.95±11.60)歲。三組性別構成、年齡無統計學差異(P>0.05)；單純糖尿病組與糖尿病腎病組患者FPG差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 基因組DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾 收集受試者空腹肘靜脈血2 ml，使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(普洛麥格生物技術有限公司)提取外周血白細胞DNA，分光光度法檢測DNA純度，-80℃保存。使用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進行DNA亞硫酸氫鈉修飾處理，未甲基化的胞嘧啶經修飾后變為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶則不發生改變。

1.3 MSP初篩各組TGF-β1基因表達調控區甲基化人群 使用ABI Primer Express 2軟件預測TGF-β1基因表達調控區CpG富含區域，尋找跨越啟動子和第一外顯子區的CpG富含區域，見圖1。使用該軟件設計MSP甲基化和非甲基化TGF-β1引物，引物區段為CpG最大富含區，位于第一外顯子區，引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR反應體系20 μl，包含經修飾后的DNA模板1 μl，含Mg2+的PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各1 μl，dNTP 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，蒸餾水10 μl。常規PCR反應條件下擴增40個循環，取10 μl產物行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統掃描成像。同一DNA分別用甲基化TGF-β1引物和非甲基化TGF-β1引物行PCR。

1.4 BSP檢測TGF-β1基因表達調控區甲基化水平 使用ABI Primer Express 2軟件以TGF-β1表達調控區CpG富含區域為靶向序列設計引物，擴增TGF-β1基因215～208序列，包括啟動子和第1外顯子序列，第1外顯子啟始位點為1，共424 bp，見圖1。PCR反應體系50 μl，其中經修飾后的DNA模板1 μl，含Mg2+的PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各1 μl，dNTP 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，蒸餾水40 μl。常規PCR反應條件下擴增42個循環。擴增產物經電泳后紫外燈下觀察目的片段，取10 μl送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。使用MUMmer軟件比對基因序列。

圖1 假定全部CG均甲基化經亞硫酸氫鈉修飾后的TGF-β1基因-215～208序列

1.5 血清TGF-β1蛋白檢測及糖尿病腎病病理分級 采用ELISA試劑盒檢測血清TGF-β1蛋白水平。根據腎小球病變程度，結合腎小管間質和血管病變進行分級：1級：單純腎小球基底膜增厚；2級：系膜輕度增生或腎小球硬化程度小于25%，無結節性硬化；3級：系膜重度增生或腎小球硬化程度25%～50%，無結節性硬化；4級：無結節性硬化或腎小球硬化程度51%～75%；若存在腎小管間質病變或血管病變則加1級。

1.6 統計學分析 采用SPSS15.0軟件，計量資料行t檢驗，計數資料進行χ2檢驗，進行Pearson檢驗和多元逐步回歸分析。

2 結 果

2.1 MSP檢測各組TGF-β1基因表達調控區甲基化狀態 健康對照組60例受試者中44例(73.33%)TGF-β1基因第一外顯子區甲基化；單純糖尿病組84例患者中36例(42.86%)呈甲基化；糖尿病腎病組98例患者中12例(12.24%)呈甲基化。單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1基因第一外顯子區甲基化比例均明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進一步降低(P<0.05)。

2.2 BSP檢測TGF-β1基因表達調控區甲基化程度 3組樣本BSP引物擴增產物測序TGF-β1基因甲基化改變集中在第59～189位點之間，共12個CpG位點。健康對照組甲基化水平為(67.81±10.25)%；單純糖尿病組為(36.74±7.18)%，明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組為(13.63±8.28)%，明顯低于健康對照組和單純糖尿病組(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組血清TGF-β1蛋白水平 健康對照組血清TGF-β1蛋白水平為(285.27±63.26)ng/L，單純糖尿病組為(1 351.18±115.02)ng/L，糖尿病腎病組為(2 874.62±380.25)ng/L；單純糖尿病組和糖尿病腎病組均明顯高于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進一步升高(P<0.05)。

2.4 糖尿病腎病組TGF-β1表達相關因素分析 血清TGF-β1蛋白表達水平與UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明顯正相關(r=0.729、0.583、0.761、0.953、0.697，P均<0.01)；與eGFR、基因甲基化呈明顯負相關(r=-0.816、-0.931，P均<0.01)。將上述有相關性的因素作為自變量進一步行多元逐步回歸分析，結果顯示，eGFR和基因甲基化與血清TGF-β1蛋白表達水平存在明顯相關性。見表1。

2.5 糖尿病腎病患者病理分級相關因素分析 血清TGF-β1蛋白表達水平與病理分級呈明顯正相關(r=0.958，P<0.01)；列聯表分析顯示，糖尿病腎病組12個CpG位點甲基化含量與病理分級相關(χ2=24.775，P<0.05)。見表2。

圖2 TGF-β1第一外顯子區甲基化水平(亞硫酸氫鹽修飾后測序)

表1 血清TGF-β1表達水平影響因素的多元逐步回歸分析

表2 各級糖尿病腎病患者甲基化含量分布(n)

病理分級12個CpG位點甲基化含量比例4/123/122/121/120合計1級46000102級26600143級4108140364級0012141238合計102226281298

3 討 論

動物模型研究顯示，腎小球系膜細胞表型轉化為糖尿病腎病發病早期的主要表現，系膜細胞增殖、胞外基質大量合成和聚積可誘發糖尿病腎病的主要病理特征，即腎小球硬化〔4〕，在此過程中，TGF-β1基因表達激活是高糖誘導系膜細胞轉分化的重要信號。本次研究顯示，糖尿病腎病患者血清TGF-β1蛋白水平明顯高于單純糖尿病患者和健康人；相關性分析也發現，血清TGF-β1蛋白水平與糖尿病腎病患者病理改變嚴重程度呈正相關，進一步證明了TGF-β1參與了糖尿病腎病的發病機制。高糖誘導TGF-β1基因表達激活的分子機制目前仍未明確。相關研究顯示，表觀遺傳學修飾，特別是表達調控區的DNA甲基化，在染色體活性喪失、基因組印跡、基因調控和穩定性方面發揮重要作用〔5〕。相關檢測發現，糖尿病腎病患者體內CTGF基因啟動子區甲基化水平低于健康對照組，而CTGF是一種分布廣泛的致纖維化生子因子，與糖尿病腎病腎小球硬化之間存在相關性，說明DNA低甲基化可能參與高糖激活分子基因表達上調的機制〔6〕。DNA甲基化多在CpG富含區域的胞嘧啶上，多定位在啟動子和第一外顯子區。本次研究先用MSP法大體檢測研究對象該區域甲基化情況，結果顯示糖尿病腎病組甲基化比例最低，進一步采用BSP測序顯示，甲基化修飾多發生在TGF-β1第一外顯子區，證實了糖尿病腎病組和單純糖尿病患者TGF-β1第一外顯子區甲基化水平明顯低于健康對照組，且糖尿病腎病患者TGF-β1甲基化水平與血清TGF-β1蛋白水平呈明顯負相關，提示糖尿病腎病患者TGF-β1基因DNA去甲基化與TGF-β1基因表達激活相關。

表達程度高的基因其甲基化程度越低，該關系也體現在基因第一外顯子CpG富含區域〔7〕，說明該區域DNA去甲基化可促進表達，該結論與本次研究發現一致。本研究發現了糖尿病腎病患者TGF-β1基因表達調控區去甲基化是高糖誘導TGF-β1基因表達激活的機制之一，低甲基化的TGF-β1基因可提升血清TGF-β1蛋白表達量，進而參與糖尿病腎病的發生發展。

1 李錦華.糖皮質激素治療血小板減少并發類固醇糖尿病臨床研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(4)：520-3.

2 張 超，胡 昭，董 帥，等.終末期腎病維持性血液透析患者生存率和死亡的影響因素〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(5)：1241-3.

3 Romagnani P,Remuzzi G.Renal progenitors in non-diabetic and diabetic nephropathies〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2013；24(1)：13-20.

4 Cherney DZI，Perkins BA，Soleymanlou N，etal.Renal hemodynamic effect of sodium-glucose cotransporter 2 inhibition in patients with type 1 diabetes mellitus〔J〕.Circulation，2014；129(5)：587-97.

5 Katherine KJ，Liu YL，Zhang JZ,etal.Renal C3 complement component：feed forward to diabetic kidney disease〔J〕.Am J Nephrol，2015；41(1)：48-56.

6 Zeng R，Duan L，Sun LN,etal.A meta-analysis on the relationship of eNOS 4b/a polymorphism and diabetic nephropathy susceptibility〔J〕.Renal Fail，2014；36(10)：1520-35.

7 Rosenberg AZ，Naicker S，Winkler CA,etal.HIV-associated nephropathies：epidemiology，pathology，mechanisms and treatment〔J〕.Nat Rev Nephrol，2015;11(3)：150-60.

〔2016-08-16修回〕

(編輯 郭 菁)

Changes of methylation and mechanism of expression of transforming growth factorβ1 gene in elderly patients with diabetic nephropathy

JIN Lin, WANG Hai-Ping.

Department of Internal Medicine,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250000,Shandong, China

Objective To observe the changes of methylation status in the regulation of transforming growth factor β1 gene expression in elderly patients with diabetic nephropathy (DN), and explore the role of methylation in the pathogenesis of DN. Methods 182 cases of elderly patients with type 2 diabetes were selected and divided into diabetes (DM) group with 84 cases and DN group with 98 cases. 60 healthy elderly healthy volunteers were selected into control group. Genomic DNA from peripheral blood of the study object was extracted and modified by hydrogen sulfate. Methylation specific PCR technique was used to detect the expression of TGF-β1 gene, and the DNA methylation level was detected by the sequencing technology after the modification of the TGF-β1 gene. ELISA method was used to detect the expression level of TGF-β1 protein. The correlation between the expression of TGF-β1 protein and the pathological grade was analyzed.Results TGFβ1 gene and significant promoter region methylation ratio in DM group and DN group were significantly lower than those of control group (P<0.05); Compared with DM group, DN group had further reduce. Methylation level of DM group was significantly lower than that in control group (P<0.05); Methylation level of DN group was significantly lower than that in control group and DM group (P<0.05). The protein levels of TGF-β1 in DM group and DN group were significantly higher than those in control group (P<0.05). protein levels of TGF-β1 of DN group was higher than that of DM group (P<0.05).The level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with UACR,BUN,Scr,FBS,PBS,and eGFR,gene methylation was significantly negatively correlated. Multiple stepwise regression analysis showed that there was a significant correlation between eGFR and gene methylation and the expression level of TGF-1 protein in serum,which was the influence factor of TGF-β1 expression. The expression level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with the pathological grading, and the methylation levels of the 12 CpG sites in the DN group were related to the pathological grading. Conclusions The methylation of TGF-β1 gene expression regulation region is an important mechanism of high glucose induced TGF-β1 gene expression in mesangial cells, which is involved in the occurrence and development of diabetic nephropathy in the elderly.

Diabetic nephropathy;DNA methylation;Transforming growth factor beta 1

國家自然科學基金項目(81200530)

王海萍(1981-)，女，副主任醫師，主要從事腎臟病基礎與臨床研究。

金 琳(1972-)，女，主管護師，主要從事心血管內科基礎及臨床研究。

R587

A

1005-9202(2016)24-6133-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.041